基于聚集誘導發(fā)光原理的熒光納米探針制備及其生物傳感和成像應用.pdf

1、熒光探針已成為了分析傳感和光學成像的有力工具。它在分子水平上可以對復雜的生物結構和過程進行可視化分析。傳統(tǒng)的染料大多數(shù)在高濃度時會熒光會減弱，甚至不發(fā)光，稱為聚集誘導淬滅效應。直到2001年，唐本忠教授課題組發(fā)現(xiàn)了另一種現(xiàn)象的染料分子，在聚集狀態(tài)時，熒光強度會大大增強，這種現(xiàn)象稱為聚集誘導發(fā)光效應效應?；诰奂T導發(fā)光分子的生物檢測方法，與基于傳統(tǒng)染料的檢測方法相比，它可以對水溶液中特定的分析物或生物過程直接地可視化檢測，并且具有更高的

2、靈敏度。本論文合成了三種發(fā)不同顏色熒光的聚集誘導發(fā)光分子，并通過共價鍵與功能核酸分子連接，開發(fā)出新的生物傳感探針，并將其應用在體外檢測早期腫瘤標志物及用于活細胞成像。本論文的主要內容包括四個方面：
　　(1)設計了一種高靈敏度的檢測miR-21的方法。實驗中用到的探針合成，只修飾了熒光團，沒有修飾其它淬滅基團，這樣可以簡化熒光基團和淬滅基團之間合適距離精確設計的復雜過程。此外，通過調節(jié)反應溫度可以提高miR-21檢測限。結果發(fā)現(xiàn)，

3、反應溫度為4oC時，檢測限可以達到10aM，相當于在50μL體積內有約300個分子。接著，將此檢測手段應用于臨床樣品的檢測，成功地檢測出21個膀胱癌患者的尿樣本。
　　(2)合成了一種發(fā)射黃色熒光的AIE分子，并將其修飾在DNA上，得到另一復合探針TPEPy-LDNA。利用該探針可以區(qū)分癌癥患者的尿液樣本和正常人的尿液樣本，同時，分別對乳腺癌細胞（MCF-7）、宮頸癌細胞（HeLa）和人胚肺成纖維細胞（HLF）三種細胞內熒光成像，

4、同時設計了另外兩種修飾傳統(tǒng)染料的探針作為對照組，分別是FAM-LDNA探針和Cy3-MBDNA探針。結果發(fā)現(xiàn)在MCF-7細胞內的熒光強度最大，因為MCF-7細胞內miR-21的表達量比其它兩種細胞的高。接著利用該探針對MCF-7細胞內miR-21長時間成像示蹤，從實驗結果發(fā)現(xiàn)，利用TPEPy-LDNA探針對細胞成像，隨著時間增加，熒光強度增強，說明了該探針染料分子具有很強的抗光漂白能力。FAM-LDNA探針的光漂白現(xiàn)象最嚴重，熒光一直在

5、減弱，甚至最后會消失，不適合在細胞內長時間熒光示蹤。
　　(3)設計出一種1：N2的信號放大的策略，Exo III作為信號放大器，可以高靈敏地檢測端粒酶活性。在端粒酶催化下，重復單位（TTAGGG）n在引物的3’端依次延長，同時，TPE-Py-DNA探針中的DNA會與重復單元雜交形成雙鏈，此時Exo III會催化水解探針中DNA部分，釋放出疏水的TPE-Py分子，TPE-Py-DNA探針會與解離出來的重復單元和再次延長的重復單元雜

6、交形成雙鏈，開始第二個周期，依次循環(huán)下去，疏水的TPE-Py分子會聚集在一起，產生與端粒酶活性有關的熒光信號，最后，可以達到目標-信號（target-to-signal）1:N2的放大比率。該方法可以用來監(jiān)測不同的細胞系（包括Hela、乳腺癌細胞（MDA-MB-231）、MCF-7、人皮膚黑色素瘤細胞（A375）、HLF和人胚肺成纖維細胞（MRC-5））的端粒酶活性變化，同時用來檢測臨床尿液樣本，得到了表現(xiàn)出良好的結果，可區(qū)分15例癌癥

7、病人的樣本和8例健康人的尿液樣品。
　　(4)成功地合成一種發(fā)紅色光的AIE分子，并將該分子通過點擊反應與DNA相連，得到復合探針TPE-R-DNA，成功應用于細胞成像。MCF-7細胞中mRNA表達量大于HeLa細胞的，實驗發(fā)現(xiàn)在MCF-7細胞中的熒光強度明顯高于HeLa細胞。同時利用蟲草素和脂多糖（LPS）分別下調和上調MCF-7細胞內mRNA的表達量時，可以從細胞熒光強弱可以觀察出細胞內mRNA表達量的變化，對研究生物過程和疾