生物熒光探針在活細(xì)胞成像中的研究與應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能起著重要作用。研究這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在細(xì)胞內(nèi)的濃度變化、位置遷移等問(wèn)題對(duì)揭示其轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的規(guī)律和機(jī)制以及針對(duì)相應(yīng)疾病進(jìn)行藥物的開(kāi)發(fā)有著十分重要的意義。近年來(lái)，新型納米材料的出現(xiàn)以及功能核酸的發(fā)展，為構(gòu)建響應(yīng)各種目標(biāo)物的生物熒光探針并將其應(yīng)用于活細(xì)胞成像提供了新的設(shè)計(jì)思路和平臺(tái)。本論文基于功能核酸與目標(biāo)物之間的相互作用，以及納米材料的光學(xué)性質(zhì)，結(jié)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的細(xì)胞成像研究熱點(diǎn)，開(kāi)發(fā)一

2、些多功能的復(fù)合型生物熒光探針，并重點(diǎn)探討探針的構(gòu)建方法以及檢測(cè)機(jī)理等問(wèn)題。本論文中構(gòu)建的生物熒光探針能靈敏且特異性地檢測(cè)對(duì)應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的非侵入式、·原位的實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像分析。具體的工作內(nèi)容如下:
　　三磷酸腺苷(ATP)，不僅是生物體的能源物質(zhì)，同時(shí)也是神經(jīng)細(xì)胞間傳遞信息的信號(hào)分子。它在星形膠質(zhì)細(xì)胞間作為“膠質(zhì)遞質(zhì)”的釋放過(guò)程參與了神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程。因此監(jiān)測(cè)ATP的釋放對(duì)相關(guān)疾病的診斷及預(yù)后

3、有著重要意義。在第2章中，基于核酸適配體與ATP結(jié)合前后的構(gòu)型變化，構(gòu)建一種錨定在細(xì)胞膜上的功能核酸生物熒光探針，用于檢測(cè)細(xì)胞ATP的釋放過(guò)程。分別在核酸適配體的5'端和3'端標(biāo)記Cy3和生物素分子，并將其與另一條3'端修飾了Cy5的部分互補(bǔ)的ssDNA雜交，得到一條帶有熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)的雜交鏈。標(biāo)記了生物素的磷脂能在低溫條件下自發(fā)的插入到細(xì)胞膜中，再利用生物素-鏈霉親和素(SA)交聯(lián)的方法將雜交鏈修飾在磷脂上，從而實(shí)現(xiàn)

4、了將功能核酸生物熒光探針錨定在細(xì)胞膜上。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ATP釋放出來(lái)會(huì)流經(jīng)細(xì)胞膜，并與錨定在細(xì)胞膜上的生物熒光探針發(fā)生相互作用，使得核酸適配體的構(gòu)象發(fā)生變化且FRET效應(yīng)被阻斷，從而探針的光學(xué)信號(hào)發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)可視化檢測(cè)ATP的釋放過(guò)程。該方法操作簡(jiǎn)單，分析成本低廉且選擇性良好，有望用于臨床研究。
　　高活性氧物質(zhì)(hROS)是一類重要的信號(hào)分子，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積累的hROS誘導(dǎo)的氧化損傷與許多疾病相關(guān)。在第3章中，開(kāi)創(chuàng)性

5、的利用首次發(fā)現(xiàn)的谷胱甘肽保護(hù)的金納米簇(AuNCs)的熒光能選擇性的被hROS猝滅的機(jī)理，特異性地檢測(cè)了均相溶液中的hROS，且針對(duì)·OH、HClO、ONOO-這三種hROS的檢測(cè)限分別為0.03μM，0.5μM，0.2μM。為了將這種“猝滅型”探針應(yīng)用于細(xì)胞成像研究中，在第4章中，構(gòu)建了一種復(fù)合型熒光納米探針，用于響應(yīng)細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)、自發(fā)產(chǎn)生hROS的活細(xì)胞成像方法。在摻雜了染料（其激發(fā)和發(fā)射峰分別在405nm和435nm處）的

6、硅納米顆粒表面修飾上鏈霉親和素，用相同的方法將AuNCs修飾上帶生物素的穿膜肽(CPP)。利用生物素-鏈霉親和素交聯(lián)的方法將兩種納米材料復(fù)合在一起，形成了具有單激發(fā)雙發(fā)射性質(zhì)的復(fù)合納米熒光探針。由于穿膜肽的作用使得該探針可以自發(fā)的進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)該探針遇到hROS時(shí)，AuNCs在565nm處的熒光強(qiáng)度降低而作為內(nèi)參的硅納米顆粒在435nm處的熒光強(qiáng)度不變。該方法選擇性好，響應(yīng)速度快，尤其是可以通過(guò)處于435nm和565nm處的兩個(gè)發(fā)射帶的比

7、值來(lái)提高熒光方法的精確度，從而避免由于探針未被細(xì)胞充分吞噬而帶來(lái)的假陽(yáng)性現(xiàn)象的產(chǎn)生。此外，與傳統(tǒng)的基于有機(jī)熒光染料探針相比，該探針生物相容性好，抗光漂白能力強(qiáng)，非常適合用于細(xì)胞內(nèi)hROS的實(shí)時(shí)成像分析。
　　細(xì)胞色素C是決定細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)。細(xì)胞色素C的釋放是引起細(xì)胞不可逆凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)。在第5章中，基于標(biāo)記了染料的核酸適配體易于吸附在氧化石墨烯的表面且熒光被猝滅的基本原理，發(fā)展一種PEG化的氧化石墨烯-核酸適配體響應(yīng)細(xì)胞色素C的

8、生物熒光納米復(fù)合物探針。利用化學(xué)交聯(lián)劑EDC/suflo-NHS，在氧化石墨烯的表面共價(jià)交聯(lián)雙氨基、分子量為1500的PEG分子，并在PEG分子的另一端氨基上修飾葉酸分子，然后再吸附識(shí)別細(xì)胞色素C的核酸適配體。與傳統(tǒng)的氧化石墨烯探針相比，該納米復(fù)合物探針的水溶性更好，靈敏度更高，檢測(cè)細(xì)胞色素C的線性范圍更寬。隨后，在第6章中將該探針用于細(xì)胞凋亡的研究，首次實(shí)現(xiàn)了直接可視化示蹤細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的熒光激活式成像過(guò)程。在細(xì)胞未凋

9、亡時(shí)，細(xì)胞色素C位于線粒體的內(nèi)外膜的間隙中，而此時(shí)的探針通過(guò)葉酸的靶向作用進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，由于兩者無(wú)法接觸所以沒(méi)有熒光信號(hào);當(dāng)細(xì)胞在藥物刺激下發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而與核酸適配體結(jié)合并遠(yuǎn)離氧化石墨烯的表面，導(dǎo)致熒光信號(hào)的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)的細(xì)胞色素C的原位檢測(cè)。細(xì)胞色素C的釋放是從細(xì)胞受到1μM星孢菌素（STS，一種凋亡誘導(dǎo)劑）刺激的15分鐘之后開(kāi)始的，并在25分鐘后全部釋放完。與利用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase