功能核酸用于環(huán)境及活細(xì)胞內(nèi)金屬離子的傳感與成像研究.pdf

1、金屬元素在整個(gè)生命體系中有雙重作用，一方面能維持動(dòng)植物的生命活動(dòng)，另一方面也可能危害其健康。因此，研究環(huán)境中及生物體內(nèi)的金屬離子含量與分布，并對(duì)其進(jìn)行有效地檢測(cè)，對(duì)于保護(hù)環(huán)境與人類(lèi)健康有積極意義。功能核酸是指具有特定生物功能，一般指能高特異性結(jié)合特定目標(biāo)物或具有某些催化功能的核酸分子。功能核酸探針在傳感方面具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):功能核酸可以通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法(SELEX)篩選獲得，理論上任何目標(biāo)物均可篩到其對(duì)應(yīng)的功能核酸;已經(jīng)篩到

2、的功能核酸可以通過(guò)合成獲得，適用于大批量生產(chǎn);一些功能核酸，如左旋核酸(L-DNA)在生理環(huán)境下更穩(wěn)定，抗酶切降解效果更好，為活體金屬離子檢測(cè)提供了可行性;最后，功能核酸可以經(jīng)歷多次變性復(fù)性而不改變其活性，更易保存，減少了設(shè)備消耗。更重要的是，一些功能核酸對(duì)金屬離子表現(xiàn)出高度特異性，且響應(yīng)信號(hào)與金屬離子含量相關(guān)，這為簡(jiǎn)單、方便、有效地檢測(cè)金屬離子提供了可能性。因此，利用功能核酸的優(yōu)點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列的生物傳感器用于檢測(cè)環(huán)境和生物體內(nèi)金

3、屬離子。
　　在第二章中，我們構(gòu)建了一種基于鉀離子傳感寡核苷酸(Potassium SensingOligonucleotide，簡(jiǎn)稱(chēng)PSO)的生物傳感器。首先用修飾有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，簡(jiǎn)稱(chēng)FRET)報(bào)告基團(tuán)對(duì)的DNA鏈來(lái)優(yōu)化PSO的終端，以獲取更高的靈敏度，然后用DNA合成儀將二?；|(zhì)組裝到PSO鏈上。在有鉀離子出現(xiàn)時(shí)，形成的G-四聚體構(gòu)型會(huì)使產(chǎn)生F

4、RET效應(yīng)的兩種熒光基團(tuán)(FAM和TAMRA)對(duì)靠近，從而導(dǎo)致FRET效率發(fā)生改變。此外，隨著K+濃度的變化，熒光強(qiáng)度比率也是可逆的?；谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，我們?cè)诩?xì)胞膜上組裝了該傳感器，并第一次將其用于實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞微環(huán)境中K+濃度的動(dòng)態(tài)變化。
　　在第三章中，我們構(gòu)造了一種在均相溶液和活性細(xì)胞中的L型凝血酶結(jié)合適配體（L-type Thrombin Binding Aptame，簡(jiǎn)稱(chēng)L-TBA）K+傳感器，通過(guò)用可預(yù)測(cè)的L-TBA的優(yōu)

5、點(diǎn)，演示基于L-TBA的K+傳感器克服了天然D-PSO的缺陷，從而在活性細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)K+成像并且表現(xiàn)出精確，安全和生物正交PSO的優(yōu)點(diǎn)。
　　在第四章中，我們基于Pb2+ DNAzymes，采用已報(bào)到的D-DNAzyme序列，根據(jù)L-DNAzyme與D-DNAzyme在存在非手性金屬離子輔因子時(shí)有類(lèi)似的催化活性，但在生物樣品中，L-DNAzyme還有額外的生物穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了L-DNAzyme識(shí)別單元的生物傳感器并將其用在環(huán)境水