固定化酶兩步催化合成阿糖鳥苷.pdf

1、阿糖鳥苷(9-beta-D-arabinofuranosylguanine，ara-G)合成抗白血病藥物奈拉濱、氟達(dá)拉濱等的重要前體。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法存在步驟繁瑣、易產(chǎn)生異構(gòu)體且異構(gòu)體不易分離等困難，而采用微生物游離細(xì)胞或酶進(jìn)行合成時(shí)，由于細(xì)胞或酶不能夠重復(fù)使用而導(dǎo)致成本較高。本文采用固定化酶技術(shù)進(jìn)行ara-G的生物合成研究，以建立連續(xù)催化的反應(yīng)工藝，達(dá)到降低生產(chǎn)成本、實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的目的。
　　利用超聲波處理將菌體細(xì)胞破碎、硫酸

2、銨分級(jí)鹽析制備酶液，通過對(duì)固定化的條件如戊二醛濃度、處理時(shí)間、酶聯(lián)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，得到兩種酶的適宜固定化條件。其中嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)固定化條件優(yōu)化為:在室溫、振蕩條件下用0.2％戊二醛與樹脂混合4h，去離子水清洗至中性，1g樹脂結(jié)合63.2 u PNPase酶，酶液與樹脂酶聯(lián)12h，過濾后用蒸餾水洗滌至中性，得到高活性固定化PNPase酶。腺苷脫氨酶(AMPDAase)固定化條件為:在室溫、振蕩條件下用0.1％戊二醛與樹脂

3、混合8h，去離子水清洗，1g樹脂結(jié)合51.4 u AMPDAase酶，酶液與樹脂酶聯(lián)10h，過濾后用蒸餾水洗滌至中性，得到高活性固定化AMPDAase酶。
　　以阿糖尿苷(ara-U)和2，6-二氨基嘌呤核苷(DAP)為底物、以固定化的PNPase酶為催化劑，在搖瓶水平考察影響阿糖2，6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA)合成的理化因素，其最優(yōu)條件為:在100ml的50 mmol/L、pH7.5磷酸鹽緩沖液中加入50 mmol/L a

4、ra-U和50 mmol/L DAP、固定化PNPase酶（樹脂）2g，60℃反應(yīng)48h。在分批反應(yīng)時(shí)，固定化PNPase酶可反復(fù)多批次使用，前5個(gè)批次反轉(zhuǎn)化率較高，最高可達(dá)84.93％，5次平均轉(zhuǎn)化率為63.9％，但之后轉(zhuǎn)化率下降較快。在分批試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了酶柱連續(xù)反應(yīng)工藝，酶柱的填徑高比為5.5，通過蠕動(dòng)泵將底物溶液連續(xù)流加到酶柱上，利用恒溫水浴裝置控制反應(yīng)的溫度。單因素分別考察連續(xù)催化反應(yīng)條件，得到最適的連續(xù)催化條件:采用pH7

5、.2的45 mmol/L磷酸鹽緩沖液，ara-U、DAP濃度分別為50 mmol/L，反應(yīng)底物流加速度為0.47 ml/min的，反應(yīng)溫度58℃。在此連續(xù)催化工藝條件下，酶柱的連續(xù)催化效果良好，在連續(xù)反應(yīng)578h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率仍然保持在42％以上，最初轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)83.74％，在連續(xù)反應(yīng)144h內(nèi)保持78.44％高轉(zhuǎn)化率。酶柱連續(xù)催化效力是游離細(xì)胞的45.5倍，是固定化酶分批次反應(yīng)的16.3倍。
　　進(jìn)一步以ara-DA作為底物、固

6、定化AMPDAase酶為催化劑，在搖瓶水平考察影響ara-G合成的理化因素，其最優(yōu)條件為:在100ml的pH7.5、150 mmol/L磷酸鹽緩沖液中加入30 mmol/L ara-DA、1.5g固定化AMPDAase酶，于58℃進(jìn)行脫氨反應(yīng)108h。在上述條件下進(jìn)行8個(gè)批次的重復(fù)反應(yīng)，其中最高轉(zhuǎn)化率為82.2％，平均轉(zhuǎn)化率為64.47％，表明固定化AMPDAase酶活穩(wěn)定，可多次重復(fù)使用。在此基礎(chǔ)上建立了酶柱連續(xù)反應(yīng)工藝。單因素分別考

7、察連續(xù)催化反應(yīng)條件，得到最適的連續(xù)催化條件:酶柱裝填的徑高比為5.5采用pH7.6的160 mmol/L磷酸鹽緩沖液，ara-DA濃度為30 mmol/L，反應(yīng)底物流加速度為0.30 ml/min的，反應(yīng)溫度54℃。在此連續(xù)催化工藝條件下，酶柱的連續(xù)催化效果良好，在連續(xù)反應(yīng)624h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率仍然保持在40％以上，最初轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)86.78％，在連續(xù)反應(yīng)192h內(nèi)保持80.33％的高轉(zhuǎn)化率。酶柱連續(xù)催化效力是游離細(xì)胞的21倍，是固定化酶