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文檔簡介
1、我國首創(chuàng)的VC兩步發(fā)酵法是惟一應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)VC微生物轉(zhuǎn)化法,其第一步為醇糖轉(zhuǎn)化,由葡糖桿菌(俗稱一步菌)將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖;第二步為糖酸轉(zhuǎn)化,由普通生酮基古龍酸菌(俗稱小菌)與其伴生菌(俗稱大菌)的混合菌系將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為VC前體2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)。兩步發(fā)酵法的糖酸轉(zhuǎn)化效率很高,但需要兩步發(fā)酵,三種微生物共同參與。若能應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)將參與兩步發(fā)酵的相關(guān)基因整合在單一宿主菌中表達,構(gòu)建一步發(fā)酵工程菌,
2、可簡化生產(chǎn)工藝、提高工藝穩(wěn)定性、節(jié)省生產(chǎn)成本,從而提升我國VC產(chǎn)業(yè)的競爭力和科技地位。本研究從VC生產(chǎn)菌株中分離轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因,為一步菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。 本課題組已從小菌基因文庫中分離得到了一種山梨糖脫氫酶基因(sdh),其表達產(chǎn)物山梨糖脫氫酶(SDH)能在體外將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA,但在大腸桿菌體內(nèi)卻不能完成轉(zhuǎn)化。本研究試圖通過轉(zhuǎn)座誘變和突變基因分析篩選VC兩步發(fā)酵菌中醇糖和糖酸轉(zhuǎn)化的其他相關(guān)基因。 利用Tn5轉(zhuǎn)
3、座系統(tǒng)對酮古龍酸菌SCB329進行了誘變,篩選不能進行糖酸轉(zhuǎn)化的突變株。從750株SCB329突變株中得到1株不產(chǎn)酸的變株,該突變株可望用于研究糖酸轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化機制或?qū)ふ蚁嚓P(guān)基因。建立了葡糖桿菌的Tn5誘變系統(tǒng),實現(xiàn)了Tn5轉(zhuǎn)座對葡糖桿菌的誘變,為葡糖桿菌山梨醇代謝途徑研究及相關(guān)基因分離奠定了基礎(chǔ)。 利用SOLEXA技術(shù)對酮古龍酸菌SCB329進行全基因組分析,測序結(jié)果通過軟件分析和數(shù)據(jù)庫比對,預(yù)測得到了基因組上山梨糖脫氫酶的開放閱
4、讀框。從SCB329基因組上擴增出7個可能的山梨糖脫氫酶的基因編碼框,并連接入帶有小菌啟動子的表達載體pBMP3上,在大腸桿菌中進行表達。經(jīng)活性染色、體外轉(zhuǎn)化反應(yīng)等方法考察表達產(chǎn)物的活性,發(fā)現(xiàn)其中1個讀框的表達產(chǎn)物具有山梨糖脫氫酶活性。該基因編碼579個氨基酸殘基組成的蛋白,pI為4.15,其生物活性嚴格依賴PQQ,能夠催化多種含羥基及羰基化合物脫氫,并能在體外將L-山梨糖直接轉(zhuǎn)化為2-KGA。根據(jù)該蛋白的上述特性,將其命名為醇醛脫氫酶
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