結(jié)合異戊二烯合成酶的表達(dá)調(diào)控和定向進(jìn)化提高釀酒酵母異戊二烯產(chǎn)量.pdf

1、異戊二烯是最簡(jiǎn)單的萜類物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于合成橡膠、醫(yī)藥和香料等。目前，異戊二烯主要來(lái)源于石油基C5餾分。石油資源緊缺和環(huán)境污染仍然是石油化工行業(yè)面臨的巨大難題。隨著合成生物學(xué)和代謝工程的快速發(fā)展，利用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)異戊二烯已成為可能。本文以真核模式微生物釀酒酵母為平臺(tái)，結(jié)合代謝調(diào)控和酶定向進(jìn)化，對(duì)釀酒酵母生物合成異戊二烯進(jìn)行了研究。
　　為了在釀酒酵母中構(gòu)建異戊二烯生物合成途徑，用GAL1啟動(dòng)子異源表達(dá)來(lái)自于銀白楊的異戊二烯合

2、成酶基因（IspS），轉(zhuǎn)入本課題組前期通過(guò)增強(qiáng)前體物供應(yīng)并削弱競(jìng)爭(zhēng)途徑構(gòu)建的釀酒酵母工程菌YXM08中。在此菌株中，異戊二烯的合成需要半乳糖的誘導(dǎo)。為了消除IspS表達(dá)對(duì)半乳糖誘導(dǎo)的依賴，在后續(xù)工作中敲除了GAL80基因，成功構(gòu)建了葡萄糖控制型異戊二烯合成途徑，得到重組菌株YXM13-ISPS。
　　釀酒酵母中異戊二烯生物合成途徑可以分成兩個(gè)模塊:上游MVA途徑和下游異戊二烯形成途徑。在YXM13-ISPS中，上游MVA途徑得到強(qiáng)

3、化，而下游異戊二烯形成途徑相對(duì)較弱，因此容易造成前體物質(zhì)DMAPP的過(guò)度積累，從而導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)受到抑制并且異戊二烯產(chǎn)量不高。為了強(qiáng)化下游異戊二烯形成途徑從而實(shí)現(xiàn)上下游模塊間的代謝流平衡，本研究主要圍繞異戊二烯合成酶(ISPS)的表達(dá)水平和催化活性兩方面開展工作。首先，為了增強(qiáng)ISPS的表達(dá)，通過(guò)過(guò)表達(dá)GAL4增加激活蛋白Gal4p的供應(yīng)量，并通過(guò)敲除內(nèi)源GAL1/710啟動(dòng)子減少對(duì)Gal4p的競(jìng)爭(zhēng)，使IspS的轉(zhuǎn)錄水平提高了6倍，搖瓶培

4、養(yǎng)中異戊二烯的產(chǎn)量從6.0mg/L提高到23.6mg/L，而旁路代謝產(chǎn)物角鯊烯的產(chǎn)量從4.1mg/L下降到2.8mg/L。同時(shí)，由于過(guò)度積累的DMAPP被高效地轉(zhuǎn)化為異戊二烯，使菌株的生物量提高了14％。其次，為了提高ISPS的催化活性，建立了基于前體物質(zhì)DMAPP細(xì)胞毒性的高通量篩選方法，并通過(guò)引入角鯊烯代謝途徑解除DMAPP毒性來(lái)驗(yàn)證其有效性。通過(guò)突變庫(kù)篩選和組合突變實(shí)現(xiàn)ISPS的定向進(jìn)化，獲得最優(yōu)突變體ISPSM4。最后結(jié)合代謝調(diào)

5、控和酶改造，將ISPSM4轉(zhuǎn)入到過(guò)表達(dá)Gal4p的工程菌中，使異戊二烯的產(chǎn)量從23.6mg/L繼續(xù)提高到50.2mg/L，細(xì)胞干重進(jìn)一步提高7.1％，而角鯊烯的產(chǎn)量則下降到2.2mg/L。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證強(qiáng)化異戊二烯形成途徑策略的有效性，對(duì)工程菌YXM13-ISPS、YXM29-ISPS和YXM29-ISPSM4進(jìn)行有氧批次發(fā)酵。與搖瓶發(fā)酵結(jié)果一致，YXM29-ISPSM4生長(zhǎng)最快，異戊二烯產(chǎn)量最高(640mg/L)。為了實(shí)現(xiàn)

6、異戊二烯的高產(chǎn)，以YXM29-ISPSM4為生產(chǎn)菌，進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵。經(jīng)過(guò)96小時(shí)發(fā)酵，最終發(fā)酵液OD600達(dá)到168，異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到3.7g/L（得率為22.9mg異戊二烯/g葡萄糖）。這是目前對(duì)真核生物進(jìn)行代謝改造所獲得的最高異戊二烯產(chǎn)量。
　　本研究結(jié)合代謝調(diào)控和酶定向進(jìn)化，對(duì)異戊二烯形成途徑進(jìn)行了強(qiáng)化，從而實(shí)現(xiàn)了上下游途徑模塊的平衡調(diào)控，最終大幅提高了異戊二烯的生物合成效率，為異戊二烯生物合成的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的技