幽門螺桿菌八聚異戊二烯焦磷酸合成酶和精氨酸酶的結構生物學研究.pdf

1、幽門螺桿菌（H. Pylori）為革蘭陰性微需氧菌，主要定植于感染患者的胃部，是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的重要致病因素，與胃癌、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關，世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌因子。H. Pylori 感染率極高，據(jù)統(tǒng)計，世界人群感染率超過50％，我國感染人群超過6億人，在某些地局部區(qū)感染率甚至達到90％以上。雖然H. Pylori 發(fā)現(xiàn)至現(xiàn)在已有超過27年的歷史，對其病原病因學、流行病學、致病機制、毒力因子、診斷

2、治療預防方法等也進行了非常深入的研究，但仍然有很多問題仍不是很清楚，如H. Pylori 感染的持續(xù)性和慢性化機制，H. Pylori 感染與胃癌之間的關系，H. Pylori 感染率高但發(fā)病率低的原因等等。深入闡明其致病機制，對有針對性地開發(fā)治療的創(chuàng)新藥物、設計治療方案、研制有效的疫苗、制定預防控制措施具有重要的理論指導意義。
　　 H. Pylori能夠成功定植于宿主胃部特殊的生理環(huán)境中，粘附胃上皮細胞進而引起多種胃部疾病，

3、與其所具有的種類和數(shù)量眾多的致病因子密切相關，如與H. Pylori 毒力直接相關的致病因子CagA、VacA、Urease、Hsp60、NAP、OipA、DupA等；與粘附和定植相關的BabA、SabA、SabB、AlpA、AlpB、IceA、HpaA 以及最近幾年發(fā)現(xiàn)的新的粘附分子HP1188和HP1430等；與耐酸相關的有碳酸酐酶、雙組份系統(tǒng)蛋白CrdS/CrdR、ArsR/ArsS等。這些蛋白都與H. Pylori的感染和致病有

4、著密切的關系。蛋白質的結構是其發(fā)揮功能的基礎，致病因子發(fā)揮作用與其獨特的空間結構密切相關。基于此，本研究擬采用結構生物學的方法，解析與H. Pylori 致病和重要生理功能密切相關的一些蛋白質的結構，通過結構明確其發(fā)揮功能和致病的分子機制，為H.Pylori 感染和致病機制研究提供理論指導。本研究共篩選了包括毒力因子、粘附分子、耐酸相關蛋白以及參與重要生理功能的酶類等20個以上的靶標，目前成功解析了其中兩個蛋白質的結構，另有三個蛋白結晶

5、，部分工作仍在進行中。
　　 本論文是對所獲得的一些主要實驗結果的總結，包括以下幾個方面的內容。
　　 第一部分為幽門螺桿菌(H. Pylori)八聚異戊二烯焦磷酸合成酶(OPPs)的結構解析及酶學機理研究。OPPs催化5個異戊二烯焦磷酸(IPP)與法尼酯焦磷酸(FPP)發(fā)生連續(xù)的縮合反應，生成40C的八聚異戊二烯焦磷酸(OPP)，OPP組成CoQ的側鏈,后者在呼吸鏈的電子傳遞中發(fā)揮了重要作用，敲除該基因后細菌的生長明顯

6、受到抑制，提示其功能的重要性。本研究克隆、表達并純化了來源于H. Pylori的OPPs蛋白，采用該蛋白生長晶體并收集了2.0?的高質量衍射數(shù)據(jù)，采用MAD法解析了OPPs的結構。通過對結構的分析，明確了該蛋白的單體結構和二體組裝方式、酶活中心的構象以及參與反應的關鍵殘基等信息，同時分析了該結構與同源結構之間的差異，提出了該家族酶類的底物招募和產物釋放機制，并確定了參與反應終止即控制產物長度的關鍵殘基。通過分子對接和建模技術獲得了底物I

7、PP、FPP、中間產物GGPP與OPPs的復合物結構，在此基礎上提出了trans-異戊二烯家族酶類的可能的催化模型，對該家族酶類的反應機制有了更加深入的認識。
　　 第二部分為H. Pylori精氨酸酶RocF的結構解析及酶活測定體系的建立。精氨酸酶是尿素循環(huán)中的一個關鍵酶，水解精氨酸生成尿素和鳥氨酸,需要在二價金屬離子存在的條件下才能發(fā)揮活性，它是H. Pylori耐酸體系的重要組成部分，在H. Pylori的適應性定植中發(fā)揮

8、了重要作用。此外，它還通過減少宿主巨噬細胞生成NO和抑制T細胞增生降低宿主的免疫應答，在H. Pylori的免疫逃逸和持續(xù)性感染中發(fā)揮了重要作用。體內外實驗證實，敲除RocF編碼基因后，H. Pylori的定植數(shù)量明顯下降，而這正是通過宿主NO合成增加造成的，提示RocF在抗機體天然免疫以及在H. Pylori的感染和致病中的重要性。與其他的精氨酸酶相比，RocF有許多不同之處，如在酸性和結合Co2+的條件下活性最強，還原劑對其活性影響

9、很大，序列中間有一個13個殘基的插入，N端C端也有明顯不同等,提示其結構可能與其他精氨酸酶存在差異?；诖耍狙芯繉ocF進行了克隆表達和純化，生長晶體并采用分子置換法成功解析了其結構，明確了參與離子結合的關鍵殘基以及活性中心的位置，并分析了RocF與其他精氨酸酶序列與折疊方式上的差異。同時建立了酶活測定體系，明確了還原劑對酶活的抑制作用以及RocF對離子的選擇性(Co2+>Ni2+>Mn2+)。目前我們正嘗試通過獲得RocF與抑制劑

10、nor-NOHA和BEC的復合物結構，并結合點突變等實驗結果對RocF的催化機理進行深入的探討。
　　 第三部分為博士期間的其他工作，包括，1)H. Pylori粘附素HpaA的初步晶體學研究，病原體的粘附和定植是發(fā)生感染和致病的前提，HpaA是H. Pylori最為重要的粘附分子，在H. Pylori與胃上皮細胞的粘附中發(fā)揮了重要作用，同時它還具有很強的免疫原性，是一種重要的保護性抗原，廣泛用于疫苗的研發(fā)。本研究成功實現(xiàn)了該蛋

11、白的可溶性表達，經(jīng)純化得到高純度的蛋白，通過大規(guī)模的搜索獲得了晶體，但晶體質量不是很好，衍射能力較弱，目前正在對晶體進行進一步的優(yōu)化。2)熱休克蛋白HspA、毒力因子CagA、耐酸相關蛋白ArsS的初步晶體學研究，HspA是一種分子伴侶蛋白，參與其他蛋白的折疊，比同源蛋白多了一段特殊的C端結構域，并且在結合Ni2+和Bi3+時呈現(xiàn)出不同的寡聚方式。CagA是H. Pylori最為重要的毒力因子，通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌至宿主細胞，通過與某些

12、蛋白相互作用發(fā)生磷酸化，進而通過一些信號通路引起胃上皮細胞極性的改變、緊密連接的破壞、肌動蛋白的交聯(lián)和拉伸以及細胞運動功能的改變，從而引起相關疾病，并且和胃癌的發(fā)生有一定的關系。而ArsR是雙組份系統(tǒng)的蛋白，可以感受菌體環(huán)境的變化從而調控一些耐酸相關蛋白的表達，與H. Pylori耐酸和適應性定植密切相關。前期工作中，對上述完整蛋白或篩選的肽段進行了克隆表達和純化，經(jīng)純化得到了高濃度的蛋白并對蛋白的性質進行了分析，但通過多輪的結晶條件的