利用代謝工程改造大腸桿菌及釀酒酵母進(jìn)行異戊二烯生物合成的基礎(chǔ)研究.pdf

1、異戊二烯是自然界分布最為廣泛、種類最為多樣化的大類生物有機(jī)化合物-類異戊二烯的合成單體，同時作為合成化學(xué)工業(yè)的基礎(chǔ)原料，被廣泛應(yīng)用于合成橡膠、醫(yī)藥、香料和農(nóng)藥等領(lǐng)域。目前工業(yè)上異戊二烯的供應(yīng)主要依賴于石油基原料，其綠色清潔生產(chǎn)仍然是當(dāng)前可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中的一大挑戰(zhàn)。大腸桿菌和釀酒酵母遺傳背景清楚、操作簡便，是工業(yè)生產(chǎn)中的理想模式微生物。因此，本研究采用大腸桿菌和釀酒酵母作為宿主菌，對微生物中異戊二烯的生物合成進(jìn)行研究。
　　在利用大

2、腸桿菌生物合成異戊二烯的研究中，首先，通過引入外源的異戊二烯合酶在大腸桿菌中構(gòu)建一條異戊二烯生物合成途徑，并通過單個基因的過表達(dá)，確定了MEP途徑中的關(guān)鍵酶（DXS,DXR和IDI），其影響力順序為IDI＞DXS＞DXR;其次，結(jié)合不同相容質(zhì)粒共存體系及多順反子方法，構(gòu)建了載體形式的多基因共表達(dá)體系，實現(xiàn)了ISPS、DXS、DXR、IDI多個限速酶的共表達(dá)，并就多基因協(xié)同作用對代謝產(chǎn)物的影響進(jìn)行了探索;然后，采用基因順序調(diào)控對MEP途徑

3、進(jìn)行了平衡調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)順序?qū)Ξ愇於┑慕K產(chǎn)量具有重要影響，當(dāng)基因表達(dá)順序與代謝途徑順序一致時，代謝產(chǎn)物積累量最高;最后，結(jié)合蛋白質(zhì)工程和代謝工程，提出了關(guān)鍵酶的共定向進(jìn)化策略，異戊二烯的生產(chǎn)率提高了60％，達(dá)到4.18 mg·g-1·h-1(細(xì)胞干重，DCW,Dry Cell Weight)。
　　在利用釀酒酵母作為工程菌株生產(chǎn)高附加值生物化學(xué)品時，多基因途徑的快速、穩(wěn)定組裝是生物合成中的一大瓶頸。為此，我們首先建立了

4、一套即插即用、選擇標(biāo)記可循環(huán)使用的整合工具盒pUMRI。為了證實其有效性，將其應(yīng)用于構(gòu)建4個基因的β-胡蘿卜素合成途徑(～10kb DNA)，8個基因的MVA途徑(～17kb DNA)和11個基因的番茄紅素生物合成途徑(～22kb DNA)。結(jié)合GAL調(diào)控系統(tǒng)，最終獲得了兩株類異戊二烯高產(chǎn)菌株，其中Y-carotene-01菌株的胡蘿卜素含量達(dá)到16.3mg/g(DCW)，BY4742-C-04菌株的角鯊烯含量達(dá)到39mg/g(DCW)

5、。
　　作為MVA途徑的前體物質(zhì)，乙酰輔酶A的充足供應(yīng)對于類異戊二烯的積累是非常重要的，為此我們就細(xì)胞質(zhì)和線粒體兩個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了代謝工程調(diào)控。在細(xì)胞質(zhì)的調(diào)控中，我們針對MVA途徑、乙酰輔酶A合成途徑及異戊二烯合成支路三個代謝模塊，提出了推-拉-敲的組合調(diào)控策略，確定并解除了各個模塊中的限速節(jié)點。綜合調(diào)控后異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到18.5mg/L，提高了394倍。在線粒體的調(diào)控中，首先，以GFP作為報告基因進(jìn)行了熒光定位表征，建立了線

6、粒體的基因定位策略。然后，將線粒體定位序列引入pURMI工具盒，在線粒體內(nèi)構(gòu)建了一條MVA途徑。為了提高異戊二烯的產(chǎn)量并緩解MVA途徑在線粒體內(nèi)構(gòu)建后造成的中間代謝積累對細(xì)胞生長造成的毒性，采用了GAL調(diào)控和好氧調(diào)控策略，異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到133mg/L，該結(jié)果證實了線粒體調(diào)控的有效性。最后，將線粒體和細(xì)胞質(zhì)兩個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了協(xié)同調(diào)控，最終異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到158mg/L。
　　本文以多基因表達(dá)方法及整合工具的建立為基礎(chǔ)，結(jié)合