三聚氰胺、沙丁胺醇及苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)的研究和應(yīng)用.pdf

1、三聚氰胺、瘦肉精等食品安全事件的頻發(fā)，使得食品安全問題一再成為社會關(guān)注的熱點。因而，建立快速檢測三聚氰胺、瘦肉精類物質(zhì)的方法迫在眉睫。本研究分別建立了測定食品中三聚氰胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法(ic-ELISA)。
　　三聚氰胺是一種重要的三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，然而，由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，因而一些不法分子為降低成本在小麥粉、飼料、奶粉等植物性或動物性高蛋白類食品中添加這種非食品性化工原料

2、，以提高其產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺本身為低毒性，但如果與三聚氰酸并用，會形成無法溶解的氰尿酸三聚氰胺，造成嚴(yán)重的腎結(jié)石。2004年、2007年先后爆發(fā)的寵物毒糧事件，2008年的三鹿奶粉事件，均是由于非法添加三聚氰胺。因而，急需建立高靈敏度、高特異性、快速、可靠的定量/篩選三聚氰胺的分析方法。在本研究中，為增強(qiáng)檢測牛奶、奶粉、飼料樣品中三聚氰胺酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)的靈敏度和特異性，采用了合理的半抗原修飾和異型抗體/包被抗

3、原組合策略。采用2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(CAAT)和三聚氰胺作為原料，合成了三種連有不同長度的連接臂末端帶羧基的三聚氰胺衍生物，并與載體蛋白偶聯(lián)制得免疫原和包被抗原。采用雜交瘤技術(shù)成功的制備了抗三聚氰胺的單克隆抗體。在最優(yōu)實驗條件下， ELISAs法測定三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.1-100 ng/mL，IC50值在1.7–3.9 ng/mL之間。與已報道文獻(xiàn)相比，靈敏度增強(qiáng)了10-300倍。同時ELISAs的交叉

4、反應(yīng)率值也證實了該分析方法的高特異性。本實驗選擇了純牛奶、奶粉、飼料等五種樣品作為加標(biāo)回收實驗樣品，用于 ELISA測定，回收率在72.8–133.0%之間，批內(nèi)變異系數(shù)(coefficients of variation, CV)為0.8–18.9%(n=3)，批間CV為2.6-20.8%(n=3)。與HPLC實驗結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.9902，相關(guān)性好。因而所建立的ELISA法經(jīng)證實是一種可行的定量/篩選三聚氰胺的分析方法。
　　

5、β-激動劑即為俗稱的瘦肉精類物質(zhì)，因食用含有β-激動劑殘留的畜產(chǎn)品而發(fā)生的中毒事件已屢見不鮮，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部先后多次頒布公告，明令禁止在飼料和動物飲用水中使用β-激動劑。沙丁胺醇是繼克倫特羅之后最常被濫用的一種β-激動劑，所以對其性質(zhì)及檢測方法的研究也越來越引起人們的重視。在本研究中，合成了三種連有不同長度連接臂的沙丁胺醇包被抗原和免疫原，成功的制備出抗沙丁胺醇的兩種多克隆抗體，建立了高靈敏度、高特異性的間接競爭ELISAs法，并

6、用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)證實了該法測定動物組織和飼料樣品時的可靠性。在最優(yōu)實驗條件下，基于兩種抗體/兩種包被抗原的四種組合條件下測定沙丁胺醇得到的ELISAs方法的IC50值在0.21-0.33 ng/mL之間，表明建立的ELISA方法具有很高的靈敏度。同時ELISA的交叉反應(yīng)率值也證實了該分析方法的高特異性。選擇豬肉和豬飼料樣品做加標(biāo)回收實驗，回收率在90.6–120.2%，批內(nèi) CV為8.4–21.1%(n=3)，批

7、間 CV為2.9-14.3%(n=3)，與LC-MS-MS實驗結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.9950，相關(guān)性好。因而，該ELISA法經(jīng)證實是一種可行的檢測沙丁胺醇的分析方法。
　　苯乙醇胺A是一種在中國非法使用的新型β-激動劑。本研究中，建立了一種高靈敏度高特異性的檢測動物組織和飼料樣品中苯乙醇胺 A的間接競爭 ELISA法，并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)進(jìn)行了方法的證實。通過還原硝基為氨基合成苯乙醇胺 A衍生物，采用重氮化法與載

8、體蛋白偶聯(lián)?？疾炝嗣庖叩乃闹煌玫目寡宓撵`敏度和特異性。所有的血清均表現(xiàn)出高靈敏度，IC50值均低于0.48 ng/mL。所建立的最靈敏的 ELISA法的靈敏度 IC50和檢出限 LOD分別為0.049 ng/mL和0.003 ng/mL。四種抗血清與萊克多巴胺、克倫特羅和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率均低于0.39%，與其余6種可添加于動物飼料中的藥物（包括兩種結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)：異丙腎上腺素、去氧腎上腺素）無交叉反應(yīng)。本實驗選擇了豬腎、豬肝、豬肉