基于單抗技術(shù)的三聚氰胺ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf_第1頁(yè)
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1、三聚氰胺(英文名:Melamine)是一種重要的三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化工原料,廣泛用于塑料、染料、化肥的生產(chǎn)和紡織行業(yè)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,長(zhǎng)期攝入三聚氰胺可能會(huì)導(dǎo)致繁殖障礙、膀胱炎、慢性腎炎、腎結(jié)石、甚至膀胱癌。目前分析三聚氰胺最常用的是液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用法,但這些方法需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程、精密的分離檢測(cè)儀器、良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和專業(yè)操作人員,所以限制了這些方法的應(yīng)用。相比之下,酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)具有樣品前處理簡(jiǎn)單、靈

2、敏度高、特異性強(qiáng)和成本低的優(yōu)點(diǎn),并能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此,開展三聚氰胺的ELISA方法的研究,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
   圍繞建立一個(gè)靈敏的三聚氰胺檢測(cè)方法的目的,本研究制備了抗三聚氰胺的單抗和酶標(biāo)抗原HRP-OVA-MEL并建立了直接和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。
   首先采用UV和SDS-PAGE法對(duì)免疫原三聚氰胺-BSA、包被原三聚氰胺-OVA進(jìn)行鑒定。用三聚氰胺-BSA免疫BABL/c小鼠后,取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤

3、細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,經(jīng)篩選獲得四株可分泌抗三聚氰胺抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為A85、B11、C4、B6。對(duì)單抗的部分免疫學(xué)特性進(jìn)行分析。特異性鑒定結(jié)果表明,C4和B6單抗與載體蛋白OVA、BSA無(wú)特異性反應(yīng),而A85、B11單抗與載體蛋白存在交叉反應(yīng)。亞類鑒定結(jié)果表明四株單抗均為IgM亞類。間接ELISA結(jié)果表明,四株單抗中C4株單克隆抗體的ELISA效價(jià)最高,腹水效價(jià)達(dá)到1:8000以上,親和常數(shù)為2.92×108L·mol-

4、1。分別用飽和硫酸銨純法、PEG6000沉淀法、優(yōu)球蛋白沉淀法純化C4細(xì)胞株的腹水,結(jié)果顯示PEG6000沉淀法純化IgM抗體,耗時(shí)較少,得率和親和力較高。
   其次,利用C4單克隆抗體建立了三聚氰胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法(ic-ELISA)。優(yōu)化后的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)條件為:4℃過(guò)夜包被抗原三聚氰胺-OVA,濃度為2.5μg/mL;5%甘氨酸37℃封閉1h;純化后的抗體工作濃度為20μg/mL,37℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h;酶標(biāo)二

5、抗1:400037℃溫育1h;底物作用20min。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,其回歸方程為y=-25.093x+62.409(R2=0.9877),IC50為3.12μg/L,線性范圍在0.05-10μg/L之間。
   最后制備了酶標(biāo)抗原HRP-OVA-MEL,并利用此酶標(biāo)抗原建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法(dc-ELISA),繪制的曲線擬合方程為y=-11.432x+70.702(R2=0.9948),符合線性關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)回歸方程

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