基于單抗技術(shù)的三聚氰胺ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、三聚氰胺（英文名：Melamine）是一種重要的三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，廣泛用于塑料、染料、化肥的生產(chǎn)和紡織行業(yè)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)期攝入三聚氰胺可能會(huì)導(dǎo)致繁殖障礙、膀胱炎、慢性腎炎、腎結(jié)石、甚至膀胱癌。目前分析三聚氰胺最常用的是液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用法，但這些方法需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程、精密的分離檢測(cè)儀器、良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和專業(yè)操作人員，所以限制了這些方法的應(yīng)用。相比之下，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）具有樣品前處理簡(jiǎn)單、靈

2、敏度高、特異性強(qiáng)和成本低的優(yōu)點(diǎn)，并能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，開展三聚氰胺的ELISA方法的研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 圍繞建立一個(gè)靈敏的三聚氰胺檢測(cè)方法的目的，本研究制備了抗三聚氰胺的單抗和酶標(biāo)抗原HRP-OVA-MEL并建立了直接和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。
　　 首先采用UV和SDS-PAGE法對(duì)免疫原三聚氰胺-BSA、包被原三聚氰胺-OVA進(jìn)行鑒定。用三聚氰胺-BSA免疫BABL/c小鼠后，取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤

3、細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，經(jīng)篩選獲得四株可分泌抗三聚氰胺抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A85、B11、C4、B6。對(duì)單抗的部分免疫學(xué)特性進(jìn)行分析。特異性鑒定結(jié)果表明，C4和B6單抗與載體蛋白OVA、BSA無(wú)特異性反應(yīng)，而A85、B11單抗與載體蛋白存在交叉反應(yīng)。亞類鑒定結(jié)果表明四株單抗均為IgM亞類。間接ELISA結(jié)果表明，四株單抗中C4株單克隆抗體的ELISA效價(jià)最高，腹水效價(jià)達(dá)到1：8000以上，親和常數(shù)為2.92×108L·mol-

4、1。分別用飽和硫酸銨純法、PEG6000沉淀法、優(yōu)球蛋白沉淀法純化C4細(xì)胞株的腹水，結(jié)果顯示PEG6000沉淀法純化IgM抗體，耗時(shí)較少，得率和親和力較高。
　　 其次，利用C4單克隆抗體建立了三聚氰胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法（ic-ELISA）。優(yōu)化后的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)條件為：4℃過(guò)夜包被抗原三聚氰胺-OVA，濃度為2.5μg/mL；5％甘氨酸37℃封閉1h；純化后的抗體工作濃度為20μg/mL，37℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1h；酶標(biāo)二

5、抗1：400037℃溫育1h；底物作用20min。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，其回歸方程為y=-25.093x+62.409（R2=0.9877），IC50為3.12μg/L，線性范圍在0.05-10μg/L之間。
　　 最后制備了酶標(biāo)抗原HRP-OVA-MEL，并利用此酶標(biāo)抗原建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（dc-ELISA），繪制的曲線擬合方程為y=-11.432x+70.702（R2=0.9948），符合線性關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)回歸方程