神經(jīng)元活性對TrkB受體再循環(huán)的調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對于調(diào)控活性依賴的突觸結(jié)構(gòu)和功能起著至關(guān)重要的作用。BDNF與TrkB受體結(jié)合后,激活TrkB受體自身的酪氨酸激酶活性,繼而激活下游磷脂酶Cy (PLCy)、磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)等一系列胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)。BDNF在調(diào)節(jié)突觸的可塑性過程中起關(guān)鍵作用,通過激活TrkB受體,其能加強早期和晚期的LTP。全長型TrkB受體(TrkB-FL)和一種截短

2、型TrkB異構(gòu)體-TrkB.T1在結(jié)合BDNF后進入不同的內(nèi)吞后分選途徑：TrkB.T1進入默認(rèn)(default)的再循環(huán)途徑,而TrkB-FL的分選則基于一種依賴內(nèi)涵體相關(guān)蛋白HRS的特殊的調(diào)節(jié)機制,并且這種調(diào)控同時依賴于TrkB自身的激酶活性,提示TrkB的內(nèi)吞后的命運存在精密的調(diào)控機制。為了研究神經(jīng)元活性對TrkB受體再循環(huán)的影響,我們設(shè)計了膜表面生物素檢測受體降解及免疫熒光定量分析受體再循環(huán)等實驗,分析了神經(jīng)元活性對TrKB受體

3、再循環(huán)的作用及其對神經(jīng)元生物學(xué)功能的影響。研究結(jié)果如下：1.神經(jīng)元活性抑制BDNF誘導(dǎo)的TrkB-FL受體向降解途徑的分選在基礎(chǔ)狀態(tài)下,BDNF刺激可以導(dǎo)致膜表面TrkB-FL量在一個小時內(nèi)迅速下降,而在Gly誘導(dǎo)的cLTP模型中,TrkB-FL的的含量無明顯下降,這一過程并非由TrkB轉(zhuǎn)錄增加所引起,而是膜表面TrkB的降解減少導(dǎo)致。2. cLTP促進TrkB-FL的再循環(huán)而不影響TrkB.T1的再循環(huán)通過可裂解生物素實驗和免疫熒光定

4、量分析進一步證明：活性條件下,TrkB-FL降解的減少是由于更多的TrkB-FL內(nèi)吞后進入再循環(huán)途徑回到細(xì)胞膜上,而TrkB.T1不受神經(jīng)元活性的影響。3. TrkB酪氨酸激酶區(qū)對其活性依賴的再循環(huán)至關(guān)重要我們構(gòu)建了缺失TrkB不同區(qū)域的突變體：△CT(缺失C末端),ΔTK(缺失酪氨酸激酶區(qū)和C末端)和KD,通過免疫熒光定量分析實驗證明TrkB△CT的再循環(huán)是活性依賴性的,TrkB△TK的再循環(huán)則不受活性調(diào)控。4. TrkB-FL和Tr

5、kB.T1分別由Rab11和Rab4介導(dǎo)的再循環(huán)首先通過免疫共沉淀實驗證實Rab11能夠與TrkB-FL結(jié)合,并且GDP結(jié)合形式的Rab11競爭性的結(jié)合TrkB, TrkB.T1不能與Rab11結(jié)合。然后通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)cLTP促進再循環(huán)的TrkB-FL與Rab11的共定位。構(gòu)建Rab11S25N, Rab4S22N質(zhì)粒模擬失活型的Rab11和Rab4,通過免疫熒光定量分析及膜表面生物素實驗證實TrkB-FL和TrkB.T1的再循環(huán)

6、分別由Rab11和Rab4介導(dǎo)。5. cLTP狀態(tài)下增加的再循環(huán)促進BDNF激活TrkB下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)cLTP刺激顯著增強1h時間點BDNF誘導(dǎo)的ERK及AKT信號通路。而轉(zhuǎn)染Rab11siRNA的神經(jīng)元其ERK, AKT磷酸化水平降低。此外,Rab11的敲除會消除cLTP刺激后BDNF誘導(dǎo)的TrkB下游信號增強。6. cLTP狀態(tài)促使TrkB再循環(huán)囊泡向樹突棘處轉(zhuǎn)運免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BDNF刺激后樹突棘頭部處TrkB增多。進一步的實驗將再

7、循環(huán)的TrkB與PSD95染色,結(jié)果顯示活性狀態(tài)下再循環(huán)的TrkB-FL與PSD95的共定位增多,失活型的Rab11抑制這種共定位。7.激活型的Rab11調(diào)控TrkB和PSD95間的相互作用通過免疫共沉淀實驗證明改變Rab11的活性,可以影響TrkB進入突觸后與PSD95的結(jié)合能力,其中持續(xù)激活形式的Rab11突變體Rab11Q70L增強TrkB/PSD95的結(jié)合。Rab11與PSD95間也有相互作用,只有Rab11Q70L可以與PSD