激活TRPV4受體對(duì)海馬神經(jīng)元存活的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：瞬時(shí)感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型(transient receptor potentialvanilloid4，TRPV4)是瞬時(shí)感受器電位受體家族成員之一。該受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在海馬、大腦皮層、丘腦、小腦等腦區(qū)均有較多表達(dá)。TRPV4受體是一種“多覺(jué)型”受體，可以被多種因素如細(xì)胞水腫、溫?zé)岽碳?、花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物等激活，該受體激活后引起以鈣離子為主的陽(yáng)離子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高。資料報(bào)道，給予TRP

2、V4受體激動(dòng)劑可以劑量依賴性地引起視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞死亡，并介導(dǎo)次聲所致的神經(jīng)元損傷。但是TRPV4受體引起細(xì)胞死亡的機(jī)制目前尚不清楚。腦缺血時(shí)由于能量代謝障礙可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫和細(xì)胞膜脂質(zhì)代謝障礙，而這些病理改變均可以激活TRPV4受體。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注過(guò)程中，TRPV4受體蛋白表達(dá)增加，給予TRPV4受體阻斷劑可以明顯減少腦梗死體積。離體實(shí)驗(yàn)也證明阻斷TRPV4受體可以減輕氧化應(yīng)激對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，對(duì)氧糖剝奪導(dǎo)致

3、的海馬CA1神經(jīng)元損傷也具有保護(hù)作用。以上報(bào)導(dǎo)提示TRPV4受體是介導(dǎo)缺血性腦損傷的一個(gè)重要靶點(diǎn)。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路是控制細(xì)胞的增殖、分化、存活和死亡的重要胞內(nèi)信號(hào)通路之一;而磷酸肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路是一個(gè)經(jīng)典的

4、抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。腦缺血時(shí)，MAPK信號(hào)通路被過(guò)度激活，而Akt信號(hào)通路被抑制是介導(dǎo)神經(jīng)損傷的重要原因。在培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞上，TRPV4受體激動(dòng)劑可以增加細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK(extracellular regulated protein kinases，ERK)和C-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase，JNK)的磷酸化水平。在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，激活TRPV4受體后可以激活PI

5、3K。在多囊腎大鼠的膽管上皮細(xì)胞上，給予TRPV4受體激動(dòng)劑可以增加Akt磷酸化水平，降低ERK磷酸化水平。以上資料提示激活TRPV4受體可以調(diào)節(jié)MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)給予TRPV4激動(dòng)劑對(duì)N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)介導(dǎo)的電流具有增強(qiáng)作用，提示激活TRPV4受體可以增強(qiáng)NMDA受體的功能。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：激活TRPV4受體對(duì)海馬

6、神經(jīng)元存活的作用及其機(jī)制。
　　目的：⑴明確激活TRPV4受體對(duì)海馬神經(jīng)元存活的作用及其機(jī)制。⑵闡明TRPV4受體介導(dǎo)缺血性腦損傷的機(jī)制。
　　方法：①制備激活TRPV4受體的在體模型:側(cè)腦室注射不同濃度劑量的TRPV4受體激動(dòng)劑GSK1016790A，制備激活TRPV4受體的在體模型。②組織化學(xué)染色:腦組織固定后石蠟包埋切片，用甲苯胺藍(lán)染色觀察GSK1016790A對(duì)海馬CA1和CA2/3區(qū)神經(jīng)元存活的作用。③蛋白印跡(W

7、estern blot):檢測(cè)GSK1016790A對(duì)海馬組織目標(biāo)蛋白表達(dá)的作用。
　　結(jié)果：⑴側(cè)腦室注射GSK1016790A在（0.1～5μM/小鼠）濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性地導(dǎo)致海馬CA1區(qū)和CA2/3區(qū)神經(jīng)元死亡。⑵給予GSK1016790A能增加NMDA受體NR2B亞基磷酸化水平。⑶給予GSK1016790A能增加ERK的磷酸化(phosphorylation of ERK，p-ERK)水平，并降低Akt的磷酸化(phos

8、phorylation of Akt，p-Akt)水平;給予NR2B亞基受體的阻斷劑Ro25-6981能有效阻斷GSK1016790A對(duì)p-ERK和p-Akt的調(diào)節(jié)作用。⑷給予NR2B的阻斷劑Ro25-6981或PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的神經(jīng)毒性作用，但是給予MAPK激酶(mitogen-activatedprotein kinase/ERK kinase，MEK)的阻斷劑U0126不能阻斷GSK1

9、016790A所致的神經(jīng)毒性作用。
　　結(jié)論：激活TRPV4受體通過(guò)磷酸化NMDA受體的NR2B亞基，下調(diào)Akt信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)損傷作用。
　　第二部分：TRPV4受體介導(dǎo)缺血性腦損傷的機(jī)制。
　　方法：⑴腦缺血再灌注模型制備:運(yùn)用血管內(nèi)線栓法阻塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈60 min，制備大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的小鼠模型。⑵腦梗死體積測(cè)定:MCAO再灌注

10、后24 h和48 h的腦片置于氯化三苯基四氮唑（tetrazolium chloride，TTC）溶液中反應(yīng)，正常腦組織呈紅色，而梗死組織呈白色，白色腦組織體積即為MCAO后腦梗死體積。⑶Hoechst染色:MCAO再灌注48 h的腦片進(jìn)行Hoechst染色以觀察海馬神經(jīng)元的凋亡。⑷蛋白印跡(Western blot):檢測(cè)MCAO再灌注不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①腦缺血再灌注1～24 h內(nèi)p-ERK蛋白水平

11、增高，p-ERK蛋白增加程度隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。②腦缺血再灌注1～24 h內(nèi)p-Akt蛋白水平在再灌注1～4 h內(nèi)增加，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，p-Akt水平明顯下降。③側(cè)腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047（10μM/鼠）能有效減小MCAO再灌注24 h和48 h腦梗死體積，并能有效降低p-ERK蛋白水平、增加p-Akt蛋白水平。④側(cè)腦室注射TRPV4受體阻斷劑HC-067047（10μM/鼠）能有效抑制MCAO再灌

12、注48 h海馬CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡，提高Bcl-2/Bax蛋白比值，抑制caspse-3剪切體蛋白水平。⑤側(cè)腦室注射TRPV4受體激動(dòng)劑GSK1016790A能降低Bcl-2/Bax蛋白比值，增加caspse-3剪切體蛋白水平，給予PI3K激動(dòng)劑740 Y-P能有效阻斷GSK1016790A的上述作用。
　　結(jié)論：綜合本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果和課題組前期的研究，在腦缺血時(shí)，TRPV4受體被過(guò)度激活，通過(guò)增強(qiáng)NMDA受體NR2B亞基的功能下調(diào)A