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文檔簡介
1、植物體內(nèi)乙烯生理作用的發(fā)揮是通過乙烯生物合成途徑及乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實現(xiàn)的。NR基因是與ETR1基因同源的乙烯受體蛋白基因,它對乙烯的接收和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)直接影響著植株的生理和生長,影響著植物的抗逆性。NR基因不僅調(diào)控果實的成熟,而且還與植株的其他生理代謝,生長發(fā)育有密切的關(guān)系。通過轉(zhuǎn)反義NR基因植株的獲得,可以研究NR基因與植株的生理代謝,植株生長、發(fā)育和果實成熟等之間的關(guān)系,鑒定NR基因的作用;還能獲得可用于生產(chǎn)實踐的耐貯藏、抗性強的新
2、品種或育種材料。 金魚草(Antirrhinum majus)為玄參科多年生草本花卉。其品種多,花色豐富而艷麗,花期長,是花壇、花境及切花的常用素材。近年來,金魚草已成為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)、特別是轉(zhuǎn)座子、花色素發(fā)育與調(diào)控和花型發(fā)育研究的重要經(jīng)典材料。 金魚草基因轉(zhuǎn)化報道還較少,由于金魚草的無菌苗生長勢極弱,從而導(dǎo)致以下胚軸為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時,因下胚軸太小太細(xì),再加上農(nóng)桿菌的侵染作用,外植體在共
3、培養(yǎng)階段幾乎全部死亡,從而使再生率和轉(zhuǎn)化率大大下降,為金魚草的基因轉(zhuǎn)化工作增加難度。 本研究結(jié)合了多倍體誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因工程兩種技術(shù),在基因轉(zhuǎn)化前采用培養(yǎng)基中加秋水仙素法進(jìn)行金魚草多倍體的誘導(dǎo),得到直徑粗于金魚草種子苗下胚軸幾倍的四倍體再生苗;外源基因的轉(zhuǎn)化采用根癌農(nóng)桿菌攜帶反義NR基因與金魚草四倍體再生苗的莖段共培養(yǎng),將反義NR外源基因?qū)虢痿~草細(xì)胞的染色體組,并通過不定芽進(jìn)行抗性標(biāo)記的篩選,對部分轉(zhuǎn)基因四倍體進(jìn)行PCR、Sout
4、hern和Northern檢測,成功獲得抗卡那霉素的四倍體金魚草植株。論文的研究結(jié)果如下: 1、以市場所售的二倍體(2n=2x=16)切花金魚草品種為材料,獲得金魚草的壯苗培養(yǎng)基的配方為1/2MS+BA1 mg/L+IAA0.2 mg/L;幼嫩莖段的分化培養(yǎng)基為MS+BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L;生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS+IBA0.5 mg/L。 2、金魚草四倍體的誘導(dǎo)采用培養(yǎng)基中加秋水仙素法,誘導(dǎo)濃
5、度和時間分別是0.1%、4 d;對部分突變體進(jìn)行PCR檢測和染色體倍性鑒定,表明四倍體金魚草誘導(dǎo)成功。經(jīng)反復(fù)繼代篩選,分離出同質(zhì)的四倍體金魚草。 3、首次將反義NR基因?qū)胨谋扼w金魚草,并獲得了部分轉(zhuǎn)基因突變體。其轉(zhuǎn)化體系如下:以四倍體金魚草的幼嫩莖段為外植體,用OD550值為0.4的農(nóng)桿菌浸染,轉(zhuǎn)入不含卡那霉素壓力再生培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)2 d后,再轉(zhuǎn)入含卡那霉素壓力的篩選培養(yǎng)基(MS+BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L
6、+卡那霉素50 mg/L+羧芐青霉素500 mg/L),通過壓力篩選獲得的抗性株為轉(zhuǎn)基因四倍體金魚草植株。 4、對轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行PCR檢測,擴(kuò)增出一條特異的電泳帶,該片段為35S啟動子的保守序列,由此表明外源基因已經(jīng)整合到金魚草細(xì)胞中;Southern檢測了部分轉(zhuǎn)基因四倍體,35S啟動子DNA和轉(zhuǎn)化植株DNA均有雜交信號,而術(shù)轉(zhuǎn)化植株的DNA無雜交信號,證明NR基因已被成功轉(zhuǎn)入到金魚草細(xì)胞中;Northern檢測了部分轉(zhuǎn)基因四倍體,
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