四倍體菘藍(lán)中優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)基因的克隆及研究.pdf

1、多倍性是植物進(jìn)化過程中一個普遍的現(xiàn)象。據(jù)估計，百分之五十到八十的被子植物都是多倍體。多倍性在開花植物中的主導(dǎo)優(yōu)勢預(yù)示著它具有適應(yīng)的意義。多倍體往往具有其二倍體祖先所不具備的性狀。其中某些性狀，如抗旱、單性生殖、抗蟲、器官巨型等，可以讓多倍體更好地適應(yīng)新的生態(tài)環(huán)境或增加多倍體在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面的機會。近期出現(xiàn)了許多利用實驗室構(gòu)建的多倍體材料來進(jìn)行多倍性研究的例子。菘藍(lán)是一種在中國被廣泛運用的中藥材原植物，它與擬南芥同屬十字花科。經(jīng)過五年的篩選

2、育種，高產(chǎn)高抗的四倍體菘藍(lán)被選育得到。前期化學(xué)成分研究的工作顯示四倍體菘藍(lán)中抗病毒有效成分高于二倍體。隨后利用擬南芥全基因組寡核苷酸芯片比較分析了二倍體和四倍體菘藍(lán)全基因組的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的表達(dá)差異。為了深入這一領(lǐng)域的研究，并為今后利用基因工程技術(shù)進(jìn)行植物育種和提高藥用植物有效化合物的含量打下基礎(chǔ)，本文首次克隆并研究了分別參與菘藍(lán)植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、木質(zhì)素單體生物合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控三個方面的七條基因。它們分別是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的亮氨酸重復(fù)

3、型類受體蛋白激酶(IiLTK)，鈣依賴蛋白激酶(IiCDPK,IiCDPK2)；參與木質(zhì)素單體生物合成的苯丙氨酸氨裂解酶(IiPAL)，咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(IiCOMT)，咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(IiCCoAOMT)；參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子(IiMYB)。 LRR型類受體蛋白激酶在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。本文采用RACE和PCR的方法，獲得了四倍體菘藍(lán)中IiLTK的全長cDNA序列及其基因組序列。多重序列比對結(jié)果表

4、明IiLTK蛋白與其他植物來源的LRR型蛋白激酶具有很高的相似性。與其他植物來源的LRR型蛋白激酶一樣，推導(dǎo)的IiLTK蛋白具有典型的LRR型蛋白激酶結(jié)構(gòu)特征：氨基端的亮氨酸重復(fù)單元，一個跨膜域，羧基端的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域。cDNA和基因組序列比對結(jié)果表明IiLTK含有16個外顯子和15個內(nèi)含子。通過基因組步移的方法獲得了IiLTK基因的5'側(cè)翼序列，其中包括TATA盒和脅迫應(yīng)答元件在內(nèi)的一些順式作用元件也被預(yù)測和分析。IiLTK

5、基因的3'側(cè)翼序列富含A+T序列，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，具備終止子的特征。RT-PCR分析證實IiLTK在四倍體和二倍體菘藍(lán)的根、莖、葉中存在表達(dá)差異。進(jìn)一步的研究表明一些防御與脅迫途徑的信號分子，如赤霉素，NaCl和脫落酸可以上調(diào)IiLTK在四倍體菘藍(lán)中的表達(dá)。冷處理也能上調(diào)IiLTK的表達(dá)，而甲基茉莉酸則會下調(diào)IiLTK的表達(dá)。 植物具有一類新的鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)，在植物生長發(fā)育，特別是逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的作用。本文采

6、用RACE和PCR的方法，獲得了四倍體菘藍(lán)中IiCDPK和IiCDPK2全長cDNA序列及其基因組序列。序列比對結(jié)果表明：IiCDPK含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，并且大部分的外顯子長度高度保守；IiCDPK2含有7個外顯子和6個內(nèi)含子，并且大部分的外顯子長度也是高度保守。通過基因組步移的方法獲得了IiCDPK2基因的5'側(cè)翼序列，其中包括TATA盒和脅迫應(yīng)答元件在內(nèi)的一些順式作用元件也被預(yù)測和分析。IiCDPK2基因的3'側(cè)翼序列富含A

7、+T序列，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，具備終止子的特征。推導(dǎo)的IiCDPK和IiCDPK2蛋白與其他植物來源的CDPK蛋白具有相似的三個功能域：激酶域，自動抑止域，羧基端的鈣結(jié)合域。多重序列比對結(jié)果表明IiCDPK和IiCDPK2蛋白與其他植物來源的CDPK蛋白具有很高的相似性。半定量RT-PCR結(jié)果表明IiCDPK和IiCDPK2在四倍體和二倍體菘藍(lán)的根、莖、葉中存在明顯表達(dá)差異。進(jìn)一步的研究表明赤霉素、NaCl和冷處理能同時上調(diào)IiCDPK和Ii

8、CDPK2的表達(dá)，甲基茉莉酸、脫落酸和水楊酸只能上調(diào)IiCDPK的表達(dá)，對IiCDPK2則有輕微的下調(diào)作用。 苯丙氨酸氨裂解酶是催化木質(zhì)素單體生物合成第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。本文采用RACE和PCR的方法，獲得了四倍體菘藍(lán)中IiPAL的全長cDNA序列及其基因組序列。對其基因組序列分析結(jié)果表明：與其他植物來源的PAL類似，IiPAL含有單個插入位點保守的內(nèi)含子，其第二個外顯子高度保守。通過基因組步移的方法獲得了IiPAL基因的5'側(cè)

9、翼序列，其中包括TATA盒和脅迫應(yīng)答元件在內(nèi)的一些順式作用元件也被預(yù)測和分析。多重序列比對結(jié)果表明IiPAL蛋白與其他植物來源的PAL蛋白具有很高的相似性。RT-PCR分析表明IiPAL在四倍體植株根和葉中的表達(dá)要高于二倍體，而在莖中兩者表達(dá)接近相同；在四倍體植株中IiPAL最高表達(dá)出現(xiàn)在根中，而在二倍體則以莖中表達(dá)為最高。進(jìn)一步的研究表明赤霉素，脫落酸，甲基茉莉酸和冷處理可以上調(diào)IiPAL在四倍體植株中的表達(dá)。 咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)

10、移酶是木質(zhì)素單體生物合成中的一個關(guān)鍵酶。本文采用RACE和PCR的方法，獲得了四倍體菘藍(lán)中IiCOMT的全長cDNA序列及其基因組序列。cDNA和基因組序列比對結(jié)果表明IiCOMT含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。多重序列比對結(jié)果表明IiCOMT蛋白與其他植物來源的COMT蛋白具有很高的相似性。IiCOMT氨基酸序列含有植物氧甲基轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ的七個特征元件，并且它也含有新定義的兩個保守元件，分別是S1元件，S2元件。半定量RT-PCR結(jié)果表明I

11、iCOMT在四倍體菘藍(lán)根、莖、葉中的表達(dá)均要高于二倍體。進(jìn)一步的研究表明赤霉素，NaCl，甲基茉莉酸，脫落酸，水楊酸和冷處理均可以上調(diào)IiCOMT在四倍體植株中的表達(dá)。 咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶是木質(zhì)素單體生物合成中的一個關(guān)鍵酶。本文采用RACE和PCR的方法，獲得了四倍體菘藍(lán)中IiCCoAOMT的全長cDNA序列及其基因組序列。IiCCoAOMT的cDNA序列全長1098個堿基，包含有一個774堿基的開放閱讀框，其編碼257個

12、氨基酸殘基。cDNA和基因組序列比對結(jié)果表明IiCCoAOMT含有5個外顯子和4個內(nèi)含子。多重序列比對結(jié)果表明IiCCoAOMT蛋白與其他植物來源的CCoAOMT蛋白具有很高的相似性。IiCCoAOMT氨基酸序列含有植物氧甲基轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ的三個特征元件：MotifA，MotifB，MotifC。RT-PCR分析表明IiCCoAOMT在四倍體植株根和葉中的表達(dá)要高于二倍體，而在莖中表達(dá)接近相同。進(jìn)一步的研究表明赤霉素，NaCl，甲基茉莉酸，