CcpA途徑介導(dǎo)麥芽糊精調(diào)節(jié)枯草芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶機(jī)制研究.pdf

1、α-淀粉酶是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、紡織和造紙等行業(yè)，但是由于枯草芽桿菌在發(fā)酵過程中存在的碳代謝阻遏現(xiàn)象會對發(fā)酵產(chǎn)物α-淀粉酶的積累產(chǎn)生重要的影響。為了揭示該種現(xiàn)象的作用機(jī)理，本課題利用實(shí)驗(yàn)室保存的B.subtilis168和B.subtilis1.769為研究對象，一方面分析了枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶差異性所在，闡明了該菌株產(chǎn)α-淀粉酶的某些內(nèi)在原因，另一方面利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了一株能在一定程度上緩解代謝阻遏的重組菌株，最后

2、通過 Red基因敲除技術(shù)成功獲得了CcpA和Hprk基因缺失的突變體，通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這兩個(gè)基因?qū)φ{(diào)控CCR效應(yīng)有著直接的關(guān)聯(lián)。主要研究如下：
　　1.首先，在研究枯草芽孢桿菌的核酸圖譜中發(fā)現(xiàn)編碼淀粉酶的起始位點(diǎn)是從和EσARNA聚合酶的啟動子區(qū)域有著50％相似度的一段下游序列中的第8號位堿基位點(diǎn)開始。對 EσARNA聚合酶的啟動子的研究可以進(jìn)一步的鑒定枯草芽孢桿菌表達(dá)淀粉酶的類型。無論在枯草芽孢桿菌中包含的是哪一類型， amyE

3、mRNA都會在穩(wěn)定期后開始快速的積累，但是由于當(dāng)發(fā)酵液中葡萄大量存在的時(shí)候這種積累開始被抑制。針對實(shí)驗(yàn)室保存的枯 B.subtilis168和B.subtilis1.769進(jìn)行相關(guān)的研究，一方面揭示發(fā)酵過程中表達(dá)α-淀粉酶產(chǎn)量和產(chǎn)酶時(shí)間的差異，另一方面從不同發(fā)酵碳源底物中兩株菌株中α-淀粉酶產(chǎn)量和還原性糖的抵抗能力的差異。通過兩方面的研究進(jìn)一步揭示影響枯草芽孢產(chǎn)α-淀粉酶的內(nèi)在因素。
　　2.其次，通過基因重組的方法，將B.sub

4、tilis168的α-淀粉酶基因amyE（除掉啟動子）整合在 Paxo1質(zhì)粒上，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒 Paxo1amyE導(dǎo)入枯B.subtilis168菌株基因組中的半乳糖苷酶基因lacZ位點(diǎn)。通過轉(zhuǎn)化篩選和重組基因分析，獲得含有重組α-淀粉酶基因的工程菌株P(guān)aE。添加四種不同的碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢測，在外加2％木糖誘導(dǎo)的情況下，重組菌株在一定程度上解除了葡萄糖等還原性糖引起的碳代謝阻遏現(xiàn)象（CCR)，提高了α-淀粉酶產(chǎn)量。
　　3.最后