從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案

1、0土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測(cè)定設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案一、綜述：一、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多特點(diǎn)各異可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑]等多種領(lǐng)域。在釀

2、造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過(guò)程中均有重要價(jià)值如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研究的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應(yīng)用【1】。常見(jiàn)產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見(jiàn)產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、凝結(jié)芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細(xì)菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體表面及水體中【4

3、】。所以此次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蠖?shí)驗(yàn)?zāi)康囊?了解生物分離提純的原理和方法技術(shù)2掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理和方法4.培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)方法的能力5.培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析問(wèn)題解決問(wèn)題和判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。三、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和生命活動(dòng)中所需的各種條件

4、。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說(shuō)，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm～30cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少【5】。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生

5、長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽(yáng)性；接觸酶陽(yáng)性；水解淀粉；VP試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營(yíng)養(yǎng)體的最高生

6、長(zhǎng)溫度大約從25℃到75℃以上；最低生長(zhǎng)溫度大約5℃到45℃；生長(zhǎng)最低pH值，從7.5—8到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營(yíng)養(yǎng)明膠（22℃）7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)用阿拉伯糖，木糖和2恒溫?fù)u床恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌箱超凈工作臺(tái)水浴箱紫外燈照射箱磁力攪拌器玻璃珠移液管涂布器顯微鏡五、實(shí)驗(yàn)方法及步驟五、實(shí)驗(yàn)方法及步驟1、初篩方法、初篩方法①制菌懸液制菌懸液：兩個(gè)土樣分別取5

7、g，放入各自裝有45mL無(wú)菌水的三角瓶，振蕩10min即為稀釋101的土壤懸浮液。每個(gè)環(huán)境的土樣裝1個(gè)錐形瓶，共2個(gè)，同時(shí)將其分為4組，編號(hào)AB。②加熱篩選有芽孢的菌加熱篩選有芽孢的菌：將2個(gè)錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無(wú)菌室里），利用恒溫水浴裝置100℃左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持15min（制懸液時(shí)就應(yīng)先開(kāi)始加熱），制成101gml的土壤懸液③梯度稀釋菌懸液：梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無(wú)菌水試管5支，用記號(hào)筆編上102、10

8、3、104、105。取已稀釋成101土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無(wú)菌的移液器吸取1mL土壤懸液加入102的無(wú)菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成102土壤稀釋液。同法從102的試管中吸取1mL稀釋液加入編號(hào)為103的無(wú)菌水試管中，混勻后即為103土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為104、105土壤稀釋液。在土壤稀釋過(guò)程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來(lái)稀釋。④涂布平板涂布平板用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開(kāi)始，從各濃度土

9、壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復(fù)）。37℃下恒溫培養(yǎng)24h。2、復(fù)篩方法、復(fù)篩方法【1】劃線接種（分區(qū)劃線法）劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線3~4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用

10、同法通過(guò)第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過(guò)第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~29C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線23次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來(lái)做染色實(shí)驗(yàn)。3、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個(gè)土樣取8個(gè)平板兩

11、兩標(biāo)記同一位置同序號(hào)標(biāo)記，一平板分5個(gè)區(qū)域，點(diǎn)接重復(fù)兩次，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點(diǎn)接后的平板中取出一組四個(gè)分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實(shí)驗(yàn)室，其他置于無(wú)菌室。實(shí)驗(yàn)室里，四個(gè)平板均加入碘液，立即觀察記錄陽(yáng)性和陰性菌落所在位置，并可同時(shí)記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽(yáng)性菌的編號(hào)，利用另一組中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上其對(duì)應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進(jìn)行編號(hào)，然后挑取部分出來(lái)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)