高分辨受激拉曼光譜顯微成像及應用研究.pdf

1、受激拉曼散射（stimulated Raman scattering,SRS）顯微成像技術(shù)是一種新興的無標記顯微成像技術(shù)，其成像襯度來源于分子振動特性，因而具有優(yōu)異的化學選擇性和化學特異性。除此之外，由于SRS顯微成像具有高分辨率、高靈敏度和無侵入性等特點，在不到十年的時間里已經(jīng)發(fā)展成為生命科學領(lǐng)域研究中的一項重要工具?；诟吖庾VSRS和多元SRS的受激拉曼光譜顯微成像更是在每一個像素點都擁有一段光譜，因此其不僅可以區(qū)分擁有重疊拉曼譜帶

2、的不同分子，還能提供更加豐富的化學信息，成為最近兩三年來研究的前沿和熱點。然而受發(fā)展時間限制，目前受激拉曼光譜顯微成像的研究還有很多方面需要完善，其應用仍然需要開拓。鑒于此，本文利用光譜聚焦以及非線性光譜壓縮和脈沖整形相結(jié)合的方法開展了高分辨受激拉曼光譜成像技術(shù)以及其在膜電位檢測和木質(zhì)素化學成分分析中的應用研究。
　　理論上，本文首先利用非線性耦合波方程對SRS信號的產(chǎn)生過程進行了推導，給出了SRS信號的表達式。分析并比較了不同非

3、共振背景下的SRS和CARS光譜線型的差異。研究了入射激光偏振對不同退偏比拉曼振動模SRS信號強度的影響，揭示了偏振調(diào)制SRS成像的基本原理。詳細討論了SRS成像中的噪聲、信噪比以及背景等問題，指出在理想情況下SRS顯微成像系統(tǒng)應具有散粒噪聲極限探測能力。
　　分析了光譜聚焦方法實現(xiàn)高光譜相干拉曼散射顯微成像的機理，并利用玻璃棒引入線性啁啾建立了一套基于光譜聚焦方法的高光譜SRS顯微成像系統(tǒng)，針對該方法中存在的拉曼頻移校準和信號強

4、度校準問題，給出了具體的解決方案。同時在應用研究方面，首次探討了利用SRS信號無標記探測細胞膜電位的可行性。以紅細胞血影為模型，完成了單個自然細胞膜的振動光譜成像，證實了高光譜SRS顯微成像探測單個細胞膜的靈敏度。通過操控細胞膜內(nèi)外離子成分改變跨膜電位，同時利用受激拉曼光譜成像觀察不同電勢下的細胞膜，發(fā)現(xiàn)SRS光譜線型隨膜電位改變發(fā)生顯著變化，結(jié)果表明SRS成像有望用于細胞膜電位的無標記測量。
　　考慮光譜聚焦方法光譜分辨率較差，

5、難以滿足指紋區(qū)的成像應用，而脈沖整形技術(shù)又不能有效利用激勵激光功率，通過理論分析非線性光譜壓縮機理和總結(jié)已報導的實驗方案，開發(fā)了一套靈活、緊湊的非線性光譜壓縮裝置，該裝置可將寬帶飛秒激光線寬壓縮至幾個波數(shù)，同時維持一半以上的激光功率，利用搭建的非線性光譜壓縮裝置所提供的高功率斯托克斯激勵光源，分別在指紋區(qū)和靜默區(qū)建立了兩套光譜分辨率優(yōu)于10cm-1的高光譜SRS顯微成像系統(tǒng)，同時在靜默區(qū)系統(tǒng)中改進了光譜掃描裝置，設計了一種基于檢流計振鏡

6、的新型脈沖內(nèi)部光譜掃描器。針對當前高光譜SRS成像主要用于動物細胞、組織和模型生物研究的現(xiàn)狀，利用分子指紋振動，開展了高光譜SRS顯微成像用于分析描繪木質(zhì)素化學成分分布的研究。以擬南芥作為模型，運用高光譜SRS顯微成像觀察對比轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥，確立了高光譜SRS顯微成像定量區(qū)分木質(zhì)素中不同化學組份并實時監(jiān)測木質(zhì)素化學成分變化的能力。將研究進一步拓展至長狗尾草和玉米秸稈，利用高光譜SRS顯微成像觀察維管束內(nèi)纖維細胞，結(jié)合多元曲線

7、分辨（multivariate curve resolution,MCR）分析，首次揭示了木質(zhì)素中醇和醛兩種不同組份在植物細胞壁內(nèi)的漸變分布。
　　最后，針對目前多元SRS成像光譜探測范圍較窄的問題，提出了一種利用反向啁啾脈沖實現(xiàn)多元SRS顯微成像的新方法，利用玻璃棒和光柵對分別對泵浦光和斯托克斯光引入正、負啁啾，建立了一套基于反向啁啾脈沖的多元SRS顯微成像系統(tǒng)，同時通過對DMSO樣品進行成像觀察，驗證了該方法的可行性。