運(yùn)用點(diǎn)擊化學(xué)法合成18F標(biāo)記的靶向腫瘤多肽.pdf

1、正電子發(fā)射斷層顯像(Positron emission tomography，PET)是目前最先進(jìn)的影像學(xué)檢查技術(shù)，是惟一可在活體上顯示生物活動(dòng)的核醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，利用正電子核素標(biāo)記靶向腫瘤的分子，合成PET顯像劑，可用于腫瘤成像以協(xié)助診斷與指導(dǎo)治療等。
　　臨床常用的顯像劑是18F-氟代脫氧葡萄糖（18F-Fluorodeoxyglucose，18F-FDG），其主要反映機(jī)體的葡萄糖代謝水平。但部分腫瘤與炎癥等假陽(yáng)性病變的鑒別診斷

2、欠佳，炎癥病變也會(huì)表現(xiàn)為高攝取。
　　為增強(qiáng)顯像劑的靶向性，學(xué)者設(shè)計(jì)了發(fā)夾狀的可激活細(xì)胞穿膜肽(Activatablecell penetrating peptide，ACPP)。其發(fā)夾結(jié)構(gòu)由基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)水解底物構(gòu)成，可被惡性腫瘤表面高表達(dá)的MMP水解。因此ACPP到達(dá)高表達(dá)MMP腫瘤細(xì)胞表面時(shí)，發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)被水解，激活的細(xì)胞穿膜肽攜帶放射性核素進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，即可用于腫瘤

3、靶向PET成像。
　　除了ACPP，提高腫瘤顯像特異度的方法還有受體顯像。
　　PET受體顯像是利用放射性核素標(biāo)記的配體與高親和力特異受體靶細(xì)胞相結(jié)合，具有配體-受體結(jié)合的高特異性和放射性檢測(cè)的高敏感性兩大優(yōu)點(diǎn)。受體顯像分為神經(jīng)遞質(zhì)受體和腫瘤受體兩大類，前者有多巴胺受體等，后者有雌、雄激素和生長(zhǎng)抑素受體(Somatostatin receptors，SSTR)等。其中，SSTR是迄今研究與應(yīng)用最廣的腫瘤受體顯像靶點(diǎn)。

4、　　SSTR是細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，分為5種亞型。除廣泛分布于人體正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織，多種腫瘤細(xì)胞表面也有表達(dá)，包括神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和其他腫瘤（如乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌等）。腫瘤組織中的受體數(shù)量與密度比正常組織更多、更高，將放射性核素標(biāo)記于生長(zhǎng)抑素或其衍生物即可用于腫瘤顯像。
　　本研究主要分為兩個(gè)部分，第一部分是探討運(yùn)用點(diǎn)擊化學(xué)法18F-FEA標(biāo)記ACPP的可行性。第二部分是通過點(diǎn)擊化學(xué)

5、法，高效、快速合成18F-TEGay標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素衍生物TOCA，合成18F-TOCA顯像劑，以用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(Neuroendocrine tumor，NET)的PET成像。
　　目的:
　　1、合成2-疊氮乙基-4-對(duì)甲苯磺酸酯，用于下一步合成18F-FEA輔基:
　　2、合成18F-FEA輔基，用于下一步的點(diǎn)擊反應(yīng);
　　3、運(yùn)用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成18F-ACPP;
　　4、18F-ACPP標(biāo)記方法

6、改進(jìn)和失敗查因;
　　5、合成18F-TEGay輔基，用于下一步的點(diǎn)擊反應(yīng);
　　6、運(yùn)用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成18F-TOCA，為后續(xù)的生物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備;
　　7、優(yōu)化點(diǎn)擊反應(yīng)溫度，觀察不同反應(yīng)溫度對(duì)放化產(chǎn)率的影響，得出最佳反應(yīng)溫度;
　　8、優(yōu)化點(diǎn)擊反應(yīng)時(shí)間，觀察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)放化產(chǎn)率的影響，得出最佳反應(yīng)時(shí)間。
　　方法:
　　1、溶于5mL水中的溴乙醇1.25g（10mmol）與疊氮鈉0.78g（1

7、2mmol）加熱至100℃攪拌反應(yīng)12小時(shí);經(jīng)二氯甲烷25mL、水2×10mL萃取三次;取有機(jī)相溶液約25mL，干燥后，加入三乙胺1.417g(2ml，14mmol)，對(duì)甲苯磺酰氯1.91g(10mmol)，常溫下攪拌4小時(shí);加入甘氨酸0.15g(2mmol)，攪拌2小時(shí);取有機(jī)相溶液，用氫氧化鈉2×50mL(1mol/L)清洗兩次，再次干燥;加熱至40℃旋干溶劑，經(jīng)硅膠柱層析法分離，收集濾過液作氫譜核磁共振檢測(cè)。
　　2、18F

8、-FEA的合成:回旋加速器采用核反應(yīng)18O(p，n)18F得到[18F]氟離子富氧水溶液，將該溶液沖洗QMA柱，[18F]氟離子富集于QMA柱上，再K2.2.2./K2CO3溶液洗脫[18F]氟離子。經(jīng)共沸除水，干燥的[18F]氟離子與2-疊氮乙基-4-對(duì)甲苯磺酸酯5mg(4.14nmol)的400μ L無(wú)水乙腈溶液，加熱至95℃密封反應(yīng)10min，85℃下緩慢氮?dú)饬鬏o助蒸餾15-20min，冰鹽水浴冷卻收集蒸餾液得到18F-FEA。<

9、br>　　3、18F-ACPP的合成:依次加入并混勻抗壞血酸鈉(Sodium L-ascobate，ASC)溶液100μL(1.5mol/L)、CuSO4溶液100μ L(0.45mol/L)和ACPP水溶液500μL(0.28nmol/L)。最后加入前一步合成的18F-FEA，加熱至60℃密封反應(yīng)15min;
　　4、(1)將ACPP加熱至60℃振蕩反應(yīng)15min后，采用Radio-HPLC檢測(cè)反應(yīng)情況，驗(yàn)證其是否會(huì)在點(diǎn)擊反應(yīng)后

10、發(fā)生裂解;
　　(2)點(diǎn)擊反應(yīng)時(shí)間由15min延長(zhǎng)至75、110、145min，觀察反應(yīng)情況;
　　(3)濃縮反應(yīng)體積，增加反應(yīng)濃度，更變?yōu)锳SC溶液50μL（3mol/L）、CuSO4溶液50μL(0.9mol/L)和ACPP水溶液100μL(1.4nmol/L)，反應(yīng)總體積由950μL減少至450μL，觀察反應(yīng)情況;
　　(4)減少Cu與ASC的用量，更變?yōu)锳SC溶液40μL(0.3mol/L)、CuSO4溶液20

11、μL(0.096mol/L)和ACPP水溶液100μL(1.4nmol/L)，觀察反應(yīng)情況;
　　(5)加入Cu+穩(wěn)定配體，更變?yōu)锳SC溶液14μL(0.3mol/L)、CuSO4溶液2μL(0.09mol/L)和ACPP水溶液100μ L(1.4nmol/L)，THPTA溶液2μ L(0.45mol/L)，觀察反應(yīng)情況;
　　5、18F-TEGay的合成:回旋加速器采用核反應(yīng)18O(p，n)18F得到[18F]氟離子富氧水

12、溶液，將該溶液沖洗QMA柱，[18F]氟離子富集于QMA柱上，再K2.2.2./K2CO3溶液洗脫[18F]氟離子。經(jīng)共沸除水，干燥的[18F]氟離子與TsOTEGay0.16mg(0.455μmol)的280μ L無(wú)水乙腈的溶液，加熱至110℃密封反應(yīng)15 min，得到18F-TEGay。
　　6、18F-TOCA的合成:依次加入并混勻ASC溶液100μL(1.05mol/L)、CuSO4溶液100μL(0.14mol/L)、T

13、HPTA溶液14μL(0.125mol/L)和TOCA溶液200μL(1.75nmol/L)。最后加入前一步合成的18F-TEGay，加熱至60℃密封反應(yīng)15min，得到產(chǎn)物18F-TOCA;
　　7、點(diǎn)擊反應(yīng)溫度的優(yōu)化:以50℃、60℃、70℃作為點(diǎn)擊反應(yīng)的溫度，保持其他反應(yīng)條件不變，分析反應(yīng)溫度對(duì)18F-TOCA放化產(chǎn)率的影響。
　　8、點(diǎn)擊反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化:以15min、30min、45min、60min作為點(diǎn)擊反應(yīng)的時(shí)

14、間，反應(yīng)溫度均為70℃，保持其他反應(yīng)條件不變，分析反應(yīng)時(shí)間對(duì)18F-TOCA放化產(chǎn)率的影響。
　　結(jié)果:
　　1、反應(yīng)得到粗產(chǎn)品，經(jīng)硅膠柱層析法分離，收集濾過液經(jīng)氫譜核磁共振檢測(cè)后確認(rèn)濾過液3為2-疊氮乙基-4-對(duì)甲苯磺酸酯。
　　2、18F-FEA標(biāo)記條件:[18F]氟離子與2-疊氮乙基-4-對(duì)甲苯磺酸酯加熱至95℃密封反應(yīng)10 min后，取少量反應(yīng)液行HPLC檢測(cè)，計(jì)算得到合成18F-TEGay的放化產(chǎn)率為98.4

15、％。
　　3、18F-ACPP標(biāo)記條件:在CuSO4/ASC的催化體系中，ACPP與18F-FEA加熱至60℃密封反應(yīng)15min后，取少量反應(yīng)液行HPLC檢測(cè)，標(biāo)記失敗;
　　4、(1)將ACPP加熱至60℃振蕩反應(yīng)15min后，不會(huì)在點(diǎn)擊反應(yīng)后發(fā)生裂解;
　　(2)點(diǎn)擊反應(yīng)時(shí)間由15min延長(zhǎng)至75、110、145min，均未標(biāo)記成功;
　　(3)濃縮反應(yīng)體積，增加反應(yīng)濃度，仍未標(biāo)記成功;
　　(4)減少

16、Cu與ASC的用量，仍未標(biāo)記成功;
　　(5)加入Cu+穩(wěn)定配體THPTA，仍未標(biāo)記成功;
　　5、18F-TEGay標(biāo)記條件:[18F]氟離子與TsOTEGay加熱至110℃密封反應(yīng)15 min后，取少量反應(yīng)液行HPLC檢測(cè)，計(jì)算得到合成18F-TEGay的放化產(chǎn)率為70％。
　　6、18F-TOCA標(biāo)記條件:在CuSO4/ASC的催化體系中，TOCA與18F-TEGay加熱至60℃密封反應(yīng)15min后，取少量反應(yīng)液

17、行HPLC檢測(cè)，計(jì)算得到合成18F-TOCA的放化產(chǎn)率為30％，兩步的總放化產(chǎn)率為21％。
　　7、最佳的點(diǎn)擊反應(yīng)溫度:以50℃、60℃、70℃作為點(diǎn)擊反應(yīng)的溫度，放化產(chǎn)率分別為17.9％、30.9％、19.2％，即60℃為最佳反應(yīng)溫度。
　　8、最佳的點(diǎn)擊反應(yīng)時(shí)間:以15min、30min、45min、60min作為點(diǎn)擊反應(yīng)的時(shí)間，放化產(chǎn)率分別為19.2％、17.7％、12.9％、9.6％，即15min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

18、r>　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)第一部分成功合成2-疊氮乙基-4-對(duì)甲苯磺酸酯、18F-FEA，但合成18F-ACPP不成功，經(jīng)以上各種改進(jìn)方法實(shí)驗(yàn)后，18F-FEA標(biāo)記ACPP的點(diǎn)擊反應(yīng)均告失敗，考慮失敗原因應(yīng)為ACPP多肽分子量較大且存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，均致標(biāo)記難度較大。
　　實(shí)驗(yàn)第二部分通過兩步一鍋法，應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，合成新型的靶向神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的生長(zhǎng)抑素類PET顯像劑;我們還探索不同反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)點(diǎn)擊反應(yīng)的影響，得到最佳的點(diǎn)