基于多肽構(gòu)建抗腫瘤靶向藥物的應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分、多西紫杉醇偶聯(lián)Hsp90抑制肽靶向藥物抗非小細(xì)胞肺癌作用研究
　　目的：以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)合成多西紫杉醇偶聯(lián)Hsp90抑制肽靶向藥物，并探討其抗非小細(xì)胞肺癌作用，為其臨床轉(zhuǎn)化研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用固相多肽合成方法構(gòu)建多西紫杉醇偶聯(lián)Hsp90抑制肽靶向藥物(DTX-P7)，并使用HPLC、質(zhì)譜對(duì)DTX-P7進(jìn)行分析。采用皮下移植造模方法，接種A549細(xì)胞8×105/100μ

2、l于裸鼠右前肢腋窩皮下制備人非小細(xì)胞肺癌裸鼠皮下移植模型。待腫瘤形成且體積達(dá)到100mm3時(shí)，將30只裸鼠隨機(jī)分成Control組、DTX組、DTX-P7組，給藥劑量按DTX濃度為10mg/kg,每周給藥1次，共給藥4周。每周2次觀察裸鼠的狀態(tài)，測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑與短徑，計(jì)算出腫瘤體積與相對(duì)腫瘤體積，記錄統(tǒng)計(jì)裸鼠的體重變化。第5周，處死裸鼠，分離裸鼠右前肢腋窩皮下的腫瘤組織，稱量腫瘤的重量。一部分腫瘤組織置于4％多聚甲醇保存，作石蠟切片，并

3、用HE染色觀察腫瘤組織的病理狀態(tài)。一部分腫瘤組織提取蛋白，探討DTX-P7對(duì)Hsp90的表達(dá)及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：我們制備并得到了DTX-P7，所用的色譜條件符合實(shí)驗(yàn)要求，質(zhì)譜分析結(jié)果圖中m/z=839.50為[M+H+K]2+峰，對(duì)應(yīng)分子量為839.50×2-1.01-39.10=1638.89，與計(jì)算單同位素分子量1638.83相符。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，各組動(dòng)物在給藥期間的體重穩(wěn)定無(wú)明顯差異，且心臟、肝臟、脾臟、肺臟

4、、腎臟、腦等重要器官均未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的明顯損傷。與Control組、DTX組相比，DTX-P7組裸鼠的相對(duì)腫瘤體積、腫瘤重量都有顯著性減小，表明DTX-P7具有顯著的抗非小細(xì)胞肺癌作用。與對(duì)照組相比，DTX和 DTX-P7組的腫瘤組織的HE染色切片出現(xiàn)大量粉紅色淡染并且無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的腫瘤壞死區(qū)域，DTX-P7組壞死情況比DTX更為嚴(yán)重，表明DTX-P7對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用。
　　結(jié)論： DTX-P7體內(nèi)對(duì)非小細(xì)胞肺癌有顯著的

5、治療作用，有望成為一種新穎的肺癌治療候選藥物。
　　第二部分、靶向肽細(xì)胞穿膜肽雙修飾的PLGA紫杉醇納米藥物的構(gòu)建及膠質(zhì)瘤治療初步研究
　　目的：以人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為研究對(duì)象，制備靶向肽-細(xì)胞穿膜肽雙修飾的PLGA紫杉醇納米粒并探討其對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用。
　　方法：運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行三輪淘選，篩選出與能人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，通過(guò)免疫組化的方法驗(yàn)證其靶向性。用可生物降解的PLGA作為載體材料，采用

6、界面沉淀法制各PLGA紫杉醇納米粒。然后通過(guò)酰胺縮合反應(yīng)將靶向肽HC、細(xì)胞穿膜肽TAT連于納米粒表面，制備靶向肽-細(xì)胞穿膜肽雙修飾的PLGA紫杉醇納米粒，并對(duì)其進(jìn)行表征，用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定粒徑、Zeta電位，高效液相色譜測(cè)定載藥量，透射電子顯微鏡觀察形貌等。通過(guò)體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)探討靶向肽-細(xì)胞穿膜肽雙修飾的PLGA紫杉醇納米粒對(duì)藥物釋放的影響，并通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
　　結(jié)果：我們篩選出能與

7、U251細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽HC，用免疫組化方法驗(yàn)證得到其靶向性良好，可以作為靶向肽。所制備的靶向肽-細(xì)胞穿膜肽雙修飾的PLGA紫杉醇納米粒的粒徑分布比較集中，平均粒徑為350.5±31.8nm，多分散系數(shù)為0.224±0.034，Zeta電位值為-31.9±5.0mV，載藥量為6.49％，納米?；境蚀笮≥^均勻的類圓球形。在紫杉醇濃度相同的1-100nM范圍內(nèi)，靶向肽-細(xì)胞穿膜肽雙修飾的PLGA紫杉醇納米粒對(duì)細(xì)胞的殺傷作用優(yōu)于傳統(tǒng)藥物