TMP1多肽受體篩選及其在腫瘤靶向治療的應(yīng)用.pdf

1、第一部分: 目的：TMP1是利用鞭毛多肽庫篩選得到，該肽能靶向識(shí)別惡性腫瘤原位灶、轉(zhuǎn)移灶甚至是微小轉(zhuǎn)移灶，根據(jù)篩選原理TMP1應(yīng)該與腫瘤細(xì)胞膜某種蛋白分子結(jié)合，因此本研究目的是篩選出TMP1在細(xì)胞表面的受體蛋白；并可能得到新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白；為解釋TMP1靶向作用、入胞機(jī)理和促凋亡作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：借助斑點(diǎn)雜交和Western blot初步證實(shí)前列腺癌細(xì)胞1E8細(xì)胞的某種膜蛋白能與TMP1發(fā)生相互作用；利用pu

2、ll-down(親和層析)方法分離與TMP1相互作用的膜蛋白，質(zhì)譜分析進(jìn)行混合物的蛋白質(zhì)鑒定與測(cè)序，獲得受體蛋白。通過共聚焦免疫熒光、競(jìng)爭(zhēng)拮抗抑制試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、Western blot和PCR方法進(jìn)行受體驗(yàn)證工作。 結(jié)果：Western blot證實(shí)TMP1與分子量約為26-28KD的前列腺癌細(xì)胞（PC-3M-1E8）蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；與TMP1相互的前列腺癌細(xì)胞（PC-3M-1E8）膜蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE，改良的藍(lán)

3、銀染色方法對(duì)蛋白進(jìn)行染色后，與對(duì)照側(cè)相比，實(shí)驗(yàn)側(cè)發(fā)現(xiàn)在分子量約為25-30KD位置出現(xiàn)一特異性的蛋白染色帶。分離該蛋白帶進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析后，證實(shí)該該蛋白為A蛋白（由于保密原因，論文中稱該蛋白為A蛋白）；共聚焦顯微鏡觀察A蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)，但以胞漿為主；競(jìng)爭(zhēng)拮抗抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的抗A蛋白抗體可以不同程度的抑制TMP1在腫瘤細(xì)胞的熒光分布強(qiáng)度，而且呈劑量依賴性；流式細(xì)胞儀技術(shù)也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞預(yù)先用抗A蛋白抗體處理后

4、，可以抑制TMP1對(duì)細(xì)胞的促凋亡作用。 結(jié)論：A蛋白為TMP1的受體，該蛋白是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白；A蛋白與TMP1相互結(jié)合促進(jìn)TMP1的入胞作用并發(fā)揮肽的促凋亡作用。 第二部分: 目的：由于TMP1有很靶向于腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的功能，因此本部分是借助TMP1的靶向性，攜帶細(xì)胞毒性肽，用于腫瘤的靶向治療。 方法：體外合成TMP1-TAT-NBD，svTMP1-TAT-NBD（變異體），TMP1-NBD，TAT

5、-NBD，TAT，F(xiàn)ITC-TMP1-TAT-NBD，F(xiàn)ITC-svTMP1-TAT-NBD和FITC-TMP1-NBD；細(xì)胞免疫熒光分析FITC-TMP1-TAT-NBD，F(xiàn)ITC-svTMP1-TAT-NBD和FITC-TMP1-NBD這三段肽對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞（前列腺癌（PC-3M-1E8和PC-3M-2B4）和乳腺癌（（MDA-MB-435S，MDA-MB-231和MCF-7）），耐藥和對(duì)化藥物敏感相配對(duì)的卵巢癌細(xì)胞（OV2

6、008和C13K）以及正常小鼠纖維細(xì)胞（NIH/3T3）的親和能力；CCK-8和流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)六種肽對(duì)配對(duì)細(xì)胞的毒性作用以及細(xì)胞凋亡的影響；電鏡觀察肽作用下的超微結(jié)構(gòu)的改變；Western blot驗(yàn)證相關(guān)的肽段對(duì)NF-κB，IKB-α和GSK-3β的影響，并運(yùn)用NF-κB激活－核轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)檢測(cè)是否發(fā)生NF-κB激活－核轉(zhuǎn)運(yùn)；動(dòng)物體內(nèi)成像證實(shí)肽是否對(duì)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶具有靶向性識(shí)別作用；并用TMP1-TAT-NBD和svTMP1-TAT-

7、NBD進(jìn)行腫瘤治療試驗(yàn)。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)證明，TMP1-NBD與TMP1相比，對(duì)高轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株的親和力明顯減弱；TMP1-TAT-NBD對(duì)高轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)比TMP1更高親和性的入胞效應(yīng)，這段肽對(duì)高轉(zhuǎn)移腫瘤和耐藥的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為相同的親和力；CCK-8的結(jié)果表明，TMP1-TAT-NBD對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性最大，TMP1-NBD對(duì)細(xì)胞的影響與對(duì)照肽相似，細(xì)胞毒性非常弱；流式細(xì)胞儀結(jié)果與CCK-8的結(jié)果表現(xiàn)為一致性，而且

8、對(duì)細(xì)胞周期有抑制作用，主要阻滯在G1期；光鏡下，TMP1-TAT-NBD致使PC-3M-1E8細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)大量崩解，滿視野為黑褐色的細(xì)胞碎屑，超微電鏡證實(shí)在腫瘤細(xì)胞的胞膜和核膜完全遭到破壞，細(xì)胞解體，同時(shí)也觀察到，在TMP1-TAT-NBD的作用下，部分細(xì)胞胞漿內(nèi)大量的糖原聚集；TMP1-TAT-NBD可以引起細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB（P65）表達(dá)減少，核轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的共聚焦結(jié)果也證實(shí)核內(nèi)的活性NF-κB的定位也明顯減少；另一方面，TMP1-T

9、AT-NBD可以引起胞漿內(nèi)GSK-3β和IKB-α的表達(dá)下降；在動(dòng)物體內(nèi)，F(xiàn)ITC-TMP1-TAT-NBD對(duì)腫瘤有很好的識(shí)別能力，而對(duì)正常的器官則沒有向性，F(xiàn)ITC-svTMP1-TAT-NBD對(duì)腫瘤無靶向性識(shí)別能力；TMP1-TAT-NBD體內(nèi)治療表明，該肽對(duì)腫瘤組織有明顯的抑制作用。而svTMP1-TAT-NBD無效應(yīng)。 結(jié)論：TMP1-TAT-NBD對(duì)高轉(zhuǎn)移腫瘤和耐藥的腫瘤細(xì)胞有高親和力，對(duì)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞、藥物敏感細(xì)胞和正常