仿生化多巴胺表面修飾納米載體的構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：
　　納米材料被廣泛研究用于細(xì)胞內(nèi)遞送不同物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)體外診斷、分子影像或靶向治療的目的。采用聚乙二醇(PEG)對(duì)不同納米粒的表面進(jìn)行修飾，可以減少納米粒表面非特異性地結(jié)合血液中的成分，從而有效降低體內(nèi)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)對(duì)納米粒的快速攝取和清除，進(jìn)而延長(zhǎng)其血液循環(huán)時(shí)間。然而，PEG修飾會(huì)在一定程度上抑制納米粒被不同細(xì)胞有效攝取。目前，發(fā)現(xiàn)新的生物分子來(lái)顯著提高納米粒的細(xì)胞內(nèi)化依然面臨巨大的挑戰(zhàn)。受貽貝中黏附蛋白主要組

2、成物質(zhì)的啟發(fā)，本論文中我們研究了通過(guò)納米粒的表面仿生學(xué)修飾來(lái)促進(jìn)細(xì)胞吞噬的工程化方法。在該策略中，我們將鄰苯二酚結(jié)構(gòu)共價(jià)錨定至可生物降解的納米粒表面，由此制備的納米粒可以更有效地被敏感和耐藥的腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞吞噬內(nèi)化。當(dāng)納米粒載有抗腫瘤藥物時(shí)，仿生化修飾可顯著增強(qiáng)抗腫瘤藥物的體外藥理活性。此外，局部注射或口服給藥后，新制備的納米粒在腫瘤局部和腸道組織呈現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的黏附性能。因此，這種仿生方法可以用來(lái)構(gòu)建功能納米材料，用于生物傳感、

3、分子成像、藥物遞送和細(xì)胞治療等不同領(lǐng)域。
　　方法：
　　1.載體材料的合成
　　2.材料的結(jié)構(gòu)表征
　　3.納米粒的制備
　　4.納米粒的表征
　　5.納米粒的體外水解
　　6.材料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
　　7.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取
　　8.流式細(xì)胞儀測(cè)定不同細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取量
　　9.不同因素對(duì)細(xì)胞攝取的影響
　　10.載有紫杉醇(PTX)的DOAP修飾納米粒

4、的體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)
　　11.DOPA修飾納米粒對(duì)腫瘤組織的黏附特性評(píng)價(jià)
　　12.DOPA修飾納米粒在小鼠胃腸道的黏附性能評(píng)價(jià)
　　結(jié)果：
　　1.FT-IR和1H NMR分析表明成功合成了預(yù)期的DSPE-PEG-DOPA和Ac-bCD;根據(jù)1H NMR譜計(jì)算得出線形縮醛與環(huán)狀縮醛的摩爾比為1.65∶1。
　　2.通過(guò)改良的的納米粒沉淀/自組裝法制得了形態(tài)較好、粒徑分布均勻、分散性較好、平均粒徑約為20

5、0 nm左右的球形納米粒。Ac-bCD納米粒在pH5.0的PBS中的水解速率大于其在pH7.4的PBS中的。
　　3.濃度為500μg/mL時(shí)，經(jīng)DOPA修飾后的納米粒與單純PEG修飾的納米粒(0％DOPA)相比，并未顯著降低B16F10和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞存活率。與B16F10細(xì)胞共孵育24 h后，0％ DOPA和80％ DOPA的Ac-bCD納米粒有相似的劑量依賴性細(xì)胞存活率曲線，且兩種納米粒的半數(shù)抑制濃度(I

6、C50)值之間無(wú)顯著性差異。
　　4.CLSM觀察結(jié)果表明，納米粒與細(xì)胞的共孵育時(shí)間為2、4、8、12h，細(xì)胞中納米粒的綠色熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，在8h時(shí)熒光強(qiáng)度最大，12 h時(shí)，熒光強(qiáng)度減弱。在不同的時(shí)間點(diǎn)，DOPA修飾的納米粒組中細(xì)胞均具有較強(qiáng)的綠色熒光強(qiáng)度，且在DOPA含量為60％時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。
　　5.細(xì)胞在4℃預(yù)先處理的條件下，不同含量DOPA修飾的納米粒的細(xì)胞攝取量均有顯著降低。同樣，細(xì)胞松弛素D和諾

7、考達(dá)唑預(yù)處理后，細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬能力也受到抑制。
　　6.不同DOPA含量的Ac-bCD納米粒可以有效負(fù)載抗癌藥物PTX，TEM觀察表明，0％ DOPA和60％ DOPA的載藥納米粒均呈規(guī)則光滑球形，粒徑分布均一，未見(jiàn)PTX結(jié)晶;其中0％ DOPA載藥納米粒粒徑平均值為170 nm，表面電位平均值為-33mV。60％ DOPA納米粒的粒徑平均值為184 nm，表面電位為-32 mV;對(duì)應(yīng)載藥量分別為9.8％和9.7％。對(duì)于B16

8、F10、HepG2、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，PTX/Ac-bCD載藥納米粒的體外活性強(qiáng)于游離PTX，且0％ DOPA和60％ DOPA修飾的PTX/Ac-bCD納米粒之間有顯著性差異;計(jì)算表明，與0％ DOPA的載藥納米粒和游離PTX相比，60％ DOPA的載藥納米粒呈現(xiàn)顯著降低的IC50值。
　　7.在腫瘤部位注射Cy7.5標(biāo)記的0％ DOPA納米粒24和48 h后，熒光主要位于腫瘤周圍。相比之下，注射Cy7.5/

9、60％ DOPA納米粒組的熒光均勻分布于腫瘤部位。此外，60％ DOPA納米粒組有較高的熒光強(qiáng)度;與0％ DOPA納米粒組相比，相對(duì)熒光強(qiáng)度在48 h時(shí)有顯著差異。腫瘤組織離體成像和定量分析顯示，60％ DOPA組的熒光強(qiáng)度顯著高于0％ DOPA組。
　　8.不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的離體成像結(jié)果和定量分析表明，12 h時(shí)60％ DOPA納米粒組的胃、腸組織的熒光強(qiáng)度高于0％ DOPA納米粒組。在24 h時(shí)，60％ DOPA納米粒組中胃部的

10、熒光強(qiáng)度弱于0％ DOPA納米粒組，而腸組織的熒光強(qiáng)度則高于對(duì)應(yīng)的0％ DOPA納米粒組，肝臟的熒光強(qiáng)度也強(qiáng)于0％ DOPA組。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)動(dòng)力學(xué)控制的縮醛化反應(yīng)合成了具有pH響應(yīng)性的縮醛化β-環(huán)糊精，即Ac-bCD材料;通過(guò)羧基-胺基偶聯(lián)反應(yīng)制備了端基DOPA修飾的DSPE-PEG，即DSPE-PEG-DOPA。
　　2.用改良的納米粒沉淀/自組裝法成功制備了表面修飾有不同含量DOPA的Ac-bCD納米

11、粒，其形態(tài)良好、粒徑分布均一，且具有pH敏感性。采用不同DOPA含量修飾的納米粒，對(duì)細(xì)胞的毒性較小，故DOPA修飾并未顯著影響納米粒的細(xì)胞毒性。
　　3.DOPA表面修飾后的Ac-bCD納米粒具有顯著增強(qiáng)的細(xì)胞吞噬行為，而60％DOPA修飾的納米粒效果最好。
　　4.載有PTX的0％ DOPA及60％ DOPA的納米粒為球形粒子，粒徑分布均一，有較高的載藥量。體外抗腫瘤評(píng)價(jià)表明，60％ DOPA的載藥納米粒的效果顯著優(yōu)于0％