仿生化多巴胺表面修飾納米載體的構建及其生物學功能研究.pdf

1、目的：
　　納米材料被廣泛研究用于細胞內(nèi)遞送不同物質(zhì)，以實現(xiàn)體外診斷、分子影像或靶向治療的目的。采用聚乙二醇(PEG)對不同納米粒的表面進行修飾，可以減少納米粒表面非特異性地結合血液中的成分，從而有效降低體內(nèi)單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)對納米粒的快速攝取和清除，進而延長其血液循環(huán)時間。然而，PEG修飾會在一定程度上抑制納米粒被不同細胞有效攝取。目前，發(fā)現(xiàn)新的生物分子來顯著提高納米粒的細胞內(nèi)化依然面臨巨大的挑戰(zhàn)。受貽貝中黏附蛋白主要組

2、成物質(zhì)的啟發(fā)，本論文中我們研究了通過納米粒的表面仿生學修飾來促進細胞吞噬的工程化方法。在該策略中，我們將鄰苯二酚結構共價錨定至可生物降解的納米粒表面，由此制備的納米粒可以更有效地被敏感和耐藥的腫瘤細胞以及正常細胞吞噬內(nèi)化。當納米粒載有抗腫瘤藥物時，仿生化修飾可顯著增強抗腫瘤藥物的體外藥理活性。此外，局部注射或口服給藥后，新制備的納米粒在腫瘤局部和腸道組織呈現(xiàn)出明顯增強的黏附性能。因此，這種仿生方法可以用來構建功能納米材料，用于生物傳感、

3、分子成像、藥物遞送和細胞治療等不同領域。
　　方法：
　　1.載體材料的合成
　　2.材料的結構表征
　　3.納米粒的制備
　　4.納米粒的表征
　　5.納米粒的體外水解
　　6.材料的細胞毒性評價
　　7.熒光顯微鏡觀察細胞對納米粒的攝取
　　8.流式細胞儀測定不同細胞對納米粒的攝取量
　　9.不同因素對細胞攝取的影響
　　10.載有紫杉醇(PTX)的DOAP修飾納米粒

4、的體外抗腫瘤活性評價
　　11.DOPA修飾納米粒對腫瘤組織的黏附特性評價
　　12.DOPA修飾納米粒在小鼠胃腸道的黏附性能評價
　　結果：
　　1.FT-IR和1H NMR分析表明成功合成了預期的DSPE-PEG-DOPA和Ac-bCD;根據(jù)1H NMR譜計算得出線形縮醛與環(huán)狀縮醛的摩爾比為1.65∶1。
　　2.通過改良的的納米粒沉淀/自組裝法制得了形態(tài)較好、粒徑分布均勻、分散性較好、平均粒徑約為20

5、0 nm左右的球形納米粒。Ac-bCD納米粒在pH5.0的PBS中的水解速率大于其在pH7.4的PBS中的。
　　3.濃度為500μg/mL時，經(jīng)DOPA修飾后的納米粒與單純PEG修飾的納米粒(0％DOPA)相比，并未顯著降低B16F10和小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞存活率。與B16F10細胞共孵育24 h后，0％ DOPA和80％ DOPA的Ac-bCD納米粒有相似的劑量依賴性細胞存活率曲線，且兩種納米粒的半數(shù)抑制濃度(I

6、C50)值之間無顯著性差異。
　　4.CLSM觀察結果表明，納米粒與細胞的共孵育時間為2、4、8、12h，細胞中納米粒的綠色熒光強度隨著時間延長逐漸增大，在8h時熒光強度最大，12 h時，熒光強度減弱。在不同的時間點，DOPA修飾的納米粒組中細胞均具有較強的綠色熒光強度，且在DOPA含量為60％時，熒光強度最強。
　　5.細胞在4℃預先處理的條件下，不同含量DOPA修飾的納米粒的細胞攝取量均有顯著降低。同樣，細胞松弛素D和諾

7、考達唑預處理后，細胞對納米粒的吞噬能力也受到抑制。
　　6.不同DOPA含量的Ac-bCD納米?？梢杂行ж撦d抗癌藥物PTX，TEM觀察表明，0％ DOPA和60％ DOPA的載藥納米粒均呈規(guī)則光滑球形，粒徑分布均一，未見PTX結晶;其中0％ DOPA載藥納米粒粒徑平均值為170 nm，表面電位平均值為-33mV。60％ DOPA納米粒的粒徑平均值為184 nm，表面電位為-32 mV;對應載藥量分別為9.8％和9.7％。對于B16

8、F10、HepG2、MCF-7、MDA-MB-231細胞，PTX/Ac-bCD載藥納米粒的體外活性強于游離PTX，且0％ DOPA和60％ DOPA修飾的PTX/Ac-bCD納米粒之間有顯著性差異;計算表明，與0％ DOPA的載藥納米粒和游離PTX相比，60％ DOPA的載藥納米粒呈現(xiàn)顯著降低的IC50值。
　　7.在腫瘤部位注射Cy7.5標記的0％ DOPA納米粒24和48 h后，熒光主要位于腫瘤周圍。相比之下，注射Cy7.5/

9、60％ DOPA納米粒組的熒光均勻分布于腫瘤部位。此外，60％ DOPA納米粒組有較高的熒光強度;與0％ DOPA納米粒組相比，相對熒光強度在48 h時有顯著差異。腫瘤組織離體成像和定量分析顯示，60％ DOPA組的熒光強度顯著高于0％ DOPA組。
　　8.不同時間點進行的離體成像結果和定量分析表明，12 h時60％ DOPA納米粒組的胃、腸組織的熒光強度高于0％ DOPA納米粒組。在24 h時，60％ DOPA納米粒組中胃部的

10、熒光強度弱于0％ DOPA納米粒組，而腸組織的熒光強度則高于對應的0％ DOPA納米粒組，肝臟的熒光強度也強于0％ DOPA組。
　　結論：
　　1.通過動力學控制的縮醛化反應合成了具有pH響應性的縮醛化β-環(huán)糊精，即Ac-bCD材料;通過羧基-胺基偶聯(lián)反應制備了端基DOPA修飾的DSPE-PEG，即DSPE-PEG-DOPA。
　　2.用改良的納米粒沉淀/自組裝法成功制備了表面修飾有不同含量DOPA的Ac-bCD納米

11、粒，其形態(tài)良好、粒徑分布均一，且具有pH敏感性。采用不同DOPA含量修飾的納米粒，對細胞的毒性較小，故DOPA修飾并未顯著影響納米粒的細胞毒性。
　　3.DOPA表面修飾后的Ac-bCD納米粒具有顯著增強的細胞吞噬行為，而60％DOPA修飾的納米粒效果最好。
　　4.載有PTX的0％ DOPA及60％ DOPA的納米粒為球形粒子，粒徑分布均一，有較高的載藥量。體外抗腫瘤評價表明，60％ DOPA的載藥納米粒的效果顯著優(yōu)于0％