可示蹤的復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎是一個全球性的健康問題，在全世界有超過3.5億乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染者。迄今在乙型病毒性肝炎防治領(lǐng)域仍存在許多重大的、尚待解決的科學(xué)問題，如對HBV生活周期和復(fù)制過程的了解仍有限；HBV侵襲肝細(xì)胞的分子機(jī)制；慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。
　　HBV感染與復(fù)制模型是研究HBV生物學(xué)特性、探索抗HBV藥物的新靶點(diǎn)、抗HBV藥物耐藥性的研究以及篩選新的抗病毒藥

2、物、評價新的免疫療法和疫苗必不可少的重要工具。
　　許多病毒通過插入外源基因，構(gòu)建了復(fù)制型病毒載體，并且在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用。如果把HBV改造為可示蹤的復(fù)制型病毒載體，將可以大大提高新型抗HBV藥物的研發(fā)效率，并有助于闡明HBV研究領(lǐng)域中許多尚待解決的科學(xué)問題。
　　鑒于上述挑戰(zhàn)，本課題利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的復(fù)制型HBV載體，結(jié)合熒光分子及熒光素酶報告基因最新進(jìn)展，構(gòu)建分別表達(dá)小分子熒光基團(tuán)(miniSOG)、

3、標(biāo)準(zhǔn)型NanolucTM熒光素酶(NanolucLuciferase，Nluc)和分泌型NanolucTM熒光素酶(SecretoryNanolucLuciferaseSecNluc)三種報告基因的復(fù)制型HBV載體，檢測重組HBV生物學(xué)特性及其，感染能力。
　　目的：利用miniSOG、Nluc、secNluc的報告特性，形成可示蹤的，復(fù)制型重組HBV載體并檢測其生物學(xué)特性及其感染能力。
　　方法：
　　1、PCR方法

4、獲得miniSOG、Nluc、secNluc全長序列。
　　2、利用基因重組技術(shù)，將所獲得的miniSOG、Nluc、secNluc序列，亞克隆至本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的復(fù)制型載體pCH-rep中，構(gòu)建如下3個質(zhì)粒：pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc。以我實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的帶有四環(huán)素調(diào)控元件和潮霉素抗性基因的野生型pTRE-HBV-C7-5為母體質(zhì)粒，將HBV部分替換為上述表達(dá)報告基因的HBV-miniSOG

5、、HBV-secNluc，獲得pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc載體。
　　3、pCH-miniSOG分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2、293、Huh7細(xì)胞系，以本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的HBV復(fù)制型載體pCH-hrGFP為對照，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后72小時細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。
　　4、質(zhì)粒pCH-3093、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pCH-miniSOG及攜帶殺稻瘟菌素抗性基因(Blastici

6、dinRegene,BsdR)和人源綠色熒光蛋白(HumanizedGreenFluorescentProtein,hrGFP)的載體pCH-BsdR、pCH-hrGFP分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72小時，提取細(xì)胞總核糖核酸(RibonucleicAcid,RNA)，Northernblot檢測HBVRNA的表達(dá)。
　　5、將上述6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72h提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，使用9H9和4/7B表面抗原(HBs

7、Ag)的混合抗體，Westernblot檢測HBV囊膜蛋白的表達(dá)(PreS1、PreS2、S)。使用mc-312抗體，Nativewesternblot檢測核心蛋白表達(dá)情況。
　　6、將上述6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，化學(xué)發(fā)光法分別定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎表面抗原(HepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)與乙型肝炎e抗原(patitisBe-antigen,HBeAg)表達(dá)。
　　7、將上述

8、6種質(zhì)粒及pTRE-3093、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc、PTRE-HBV-hrGFP分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)，Southernblot檢測重組體復(fù)制中間體的表達(dá)。
　　8、將上述6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72小時提取細(xì)胞上清液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液用內(nèi)切酶DpnI、DNaseI及核酸酶預(yù)處理，實(shí)時熒光定量PCR檢

9、測乙型肝炎病毒載量(HepatitisBvirusdeoxyribonucleicacid,HBV-DNA)。
　　9、pCH-Nluc、pCH-secNluc分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系。使用promega的Nano-GloLuciferase檢測試劑在轉(zhuǎn)染后不同時間點(diǎn)(24h、48h、72h、96h、120h)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)Nluc及細(xì)胞培養(yǎng)液中secNluc活性。
　　10、將pCH-secNluc載體瞬時轉(zhuǎn)染hepG2細(xì)

10、胞，收集病毒顆粒，感染HepaRG細(xì)胞系，感染后不同時間（第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天）測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中熒光素酶活性，評價其感染能力。
　　結(jié)果：
　　1、聚合酶連反應(yīng)(ploymerasechainreaction,PCR)成功擴(kuò)增出了miniSOG、Nluc、secNluc三個片段。并插入復(fù)制型HBV載體構(gòu)建了如下質(zhì)粒：pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pTRE-H

11、BV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc，大小、酶切以及測序鑒定，與理論序列相同。
　　2、表達(dá)綠色熒光蛋白的復(fù)制型HBV載體熒光強(qiáng)度觀察：轉(zhuǎn)染后72h，熒光顯微鏡下觀察，miniSOG與hrGFP在HepaG2、Huh7、293三種細(xì)胞系內(nèi)均見有熒光表達(dá)，miniSOG熒光強(qiáng)度要弱于hrGFP。
　　3、復(fù)制型HBV載體HBVRNA的表達(dá)：上述（方法-4）轉(zhuǎn)染的復(fù)制型HBV載體均可見轉(zhuǎn)錄出HBV前基因組RNA

12、(pregenomicRNA，pgRNA)和亞基因組RNA(SubgenomicRNA,sgRNA)。與野生型HBV比較，pgRNA大小均較大。
　　4、復(fù)制型HBV載體囊膜蛋白的表達(dá)：上述（方法-4）轉(zhuǎn)染的復(fù)制型HBV載體均檢測到與野生型HBV相似的大、中、小蛋白。
　　5、復(fù)制型HBV載體核心蛋白的表達(dá)：上述（方法-4）轉(zhuǎn)染的復(fù)制型HBV載體均檢測到HBV核心蛋白的表達(dá)，與野生型HBV相似。
　　6、復(fù)制型HBV載

13、體HbsAg與HBeAg的表達(dá)：上述（方法-4）轉(zhuǎn)染的復(fù)制型HBV載體與野生型HBV載體比較，HBsAg與HBeAg在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的定量水平相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　7、Southernblot檢測分析復(fù)制型HBV載體在細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HBVDNA表達(dá)情況：與野生型HBV比較，攜帶BsdR(399bp)、miniSOG(312bp)的復(fù)制型HBV載體無論是在細(xì)胞外還是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制水平下降不明顯，而攜帶Nluc(

14、513bp)、secNluc(597bp)、hrGFP(720bp)載體HBV復(fù)制能力較弱。
　　8、復(fù)制型HBV載體分泌HBVDNA的檢測：與野生型HBV比較，上述（方法-4）轉(zhuǎn)染的各重組復(fù)制型HBV載體在細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV-DNA，分泌水平有所下降(P<0.05)，但仍能達(dá)到106copies/mL以上。
　　9、熒光素酶分析：pCH-Nluc,pCH-secNluc轉(zhuǎn)染HepaG2細(xì)胞，于24h、48h、72h、96h

15、、120h分別監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)液中熒光素酶表達(dá)活性，在不同時間點(diǎn)，熒光素酶的信號強(qiáng)度不同。在24h、48h、72h逐漸上升，在72h時Nluc發(fā)光值可高達(dá)4.5ⅹ109以上，secNluc發(fā)光值可達(dá)2ⅹ109以上，96h開始有下降趨勢，但仍處于較高水平。
　　10、HepRG細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)：表達(dá)secNluc的病毒感染HepRG細(xì)胞后，分別在第0、2、4、6、8、10天監(jiān)測熒光素酶活性，于第6天熒光素酶活性最高，可達(dá)106水平，

16、第8天仍保持此水平，第10天開始下降。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了帶有報告基因的重組HBV載體：pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNLuc。通過對復(fù)制型HBV載體生物學(xué)特性檢測，證明了攜帶報告基因的復(fù)制型HBV載體具備一定的復(fù)制、表達(dá)能力，所形成的重組HBV具有感染性。通過可易觀察的熒光蛋白和靈敏的熒光素酶檢測，將有助于HBV分子生物學(xué)研究及抗HB