小鼠胚胎呼吸內(nèi)胚層形態(tài)發(fā)生與咽前間充質(zhì)發(fā)育及流出道分隔的關(guān)系.pdf

1、研究背景：Hedgehog（Hh）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)胚胎不同器官的發(fā)育、分化過程中發(fā)揮重要作用。Hh蛋白是一種成形素，SonicHedgehog（Shh）信號(hào)的傳遞受靶細(xì)胞膜上兩種受體Ptc和Smo的控制，Shh與其受體Ptc結(jié)合，以負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式，調(diào)節(jié)Shh的降解和釋放，在組織中形成不同的濃度閾值，誘導(dǎo)胚胎原始細(xì)胞向不同的方向分化，并調(diào)控胚胎發(fā)育過程中的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，及Ptc1、Ptc2在組織中的表達(dá)強(qiáng)度與Shh的分泌量。Shh受

2、體Ptc1對(duì)Shh另一受體Smo有抑制作用，Shh與Ptc1結(jié)合，解除Ptc1對(duì)Smo的抑制，Smo活性增加，調(diào)節(jié)下游Gli等轉(zhuǎn)錄因子的活性，在不同的組織啟動(dòng)不同的基因表達(dá)，控制細(xì)胞向不同方向分化。近年研究表明，基因敲除或組織特異性敲除小鼠內(nèi)胚層Shh基因和Smo基因，引起多種心流出道及心房發(fā)育畸形。轉(zhuǎn)錄因子ISL-1是第二生心區(qū)心肌前體細(xì)胞較好的標(biāo)記蛋白，在原始心管形成后，調(diào)控第二生心區(qū)間充質(zhì)細(xì)胞向心管內(nèi)添加不同細(xì)胞成分。ISL-1基

3、因敲除小鼠胚胎心臟右心室、流出道及大部分心房組織缺失。胚胎前腸腹側(cè)咽前ISL-1表達(dá)陽性間充質(zhì)是第二生心區(qū)的重要組成部分，有關(guān)內(nèi)胚層與小鼠胚胎心發(fā)育的關(guān)系只限于對(duì)轉(zhuǎn)基因、敲基因小鼠的研究，在正常小鼠胚胎心發(fā)育過程中，咽前ISL-1陽性間充質(zhì)與內(nèi)胚層發(fā)育的關(guān)系及Shh信號(hào)系統(tǒng)成員在內(nèi)胚層的表達(dá)特點(diǎn)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫熒光化學(xué)染色方法，觀察Hedgehog信號(hào)通路中Shh、Ptc1、Ptc2、Smo在前腸內(nèi)胚層的時(shí)空表達(dá)

4、特點(diǎn)，探討其與第二生心區(qū)ISL-1陽性間充質(zhì)細(xì)胞在心臟流出道分隔中的相互作用，為進(jìn)一步研究流出道發(fā)育機(jī)制，揭示由于基因突變引起的流出道發(fā)育畸形而導(dǎo)致的先心病的發(fā)病機(jī)制以及為條件性敲除內(nèi)胚層Shh基因后形成的流出道發(fā)育畸形提供一定的形態(tài)和理論依據(jù)。
　　研究目的：探討呼吸內(nèi)胚層與咽前間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系及對(duì)小鼠胚胎心流出道分隔的影響。
　　研究方法：45只胚齡8-13d小鼠胚胎心連續(xù)石蠟切片，用抗胰島因子1（ISL-1）、抗α

5、-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、抗音猬因子（音速波狀蛋白）（Shh）、抗Patched（Ptc1）、抗Patched2（Ptc2）、抗Smoothened（Smo）、抗心肌肌球蛋白重鏈（MHC）抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色。
　　研究結(jié)果：胚齡8d，ISL-1表達(dá)陽性細(xì)胞分布在心包腔背側(cè)壁及前腸兩側(cè)間充質(zhì)，并延伸至原始心管動(dòng)脈端。原始心管心肌顯Shh受體Ptc1、Ptc2較強(qiáng)表達(dá)，未顯Shh陽性表達(dá)，不同胚層細(xì)胞均可見Smo

6、表達(dá)。胚齡8.5-9d，成襻中的心管Ptc1、Ptc2和Smo表達(dá)與MHC表達(dá)模式相同，Shh在前腸內(nèi)胚層可見陽性表達(dá)。胚齡10-10.5d，動(dòng)脈囊背側(cè)與前腸腹側(cè)之間的間充質(zhì)中開始出現(xiàn)ISL-1陽性細(xì)胞。呼吸內(nèi)胚層發(fā)育部位顯較強(qiáng)Ptc1、Ptc2熒光或強(qiáng)陽性顆粒狀染色，同時(shí)顯Smo陽性表達(dá)及MHC陰性表達(dá)。胚齡11-11.5d，前腸腹側(cè)較厚的呼吸內(nèi)胚層上皮表達(dá)較強(qiáng)的Ptc1和Ptc2，呼吸內(nèi)胚層細(xì)胞不但顯ISL-1陽性表達(dá)，以呼吸內(nèi)胚層

7、為中心，ISL-1陽性的咽前間充質(zhì)細(xì)胞圍繞呼吸內(nèi)胚層形成對(duì)稱的錐體形結(jié)構(gòu)。ISL-1陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Smo，Shh僅表達(dá)于神經(jīng)管腹側(cè)、脊索、心血管內(nèi)皮。胚齡12d，在流出道水平，氣管上皮及其腹側(cè)的內(nèi)胚層上皮細(xì)胞索變的較為粗短，仍保持較強(qiáng)的Ptc1和Ptc2表達(dá)。氣管腹側(cè)仍可見ISL-1和Smo雙陽性的錐體形結(jié)構(gòu)，頂端指向主肺動(dòng)脈隔。主肺動(dòng)脈隔ISL-1陽性表達(dá)大部消失，轉(zhuǎn)為較強(qiáng)的α-SMA表達(dá)。胚齡13d，Ptc1、Ptc2在氣管上皮的

8、表達(dá)消失，動(dòng)脈壁及主肺動(dòng)脈隔仍可見少量ISL-1陽性細(xì)胞，但氣管腹側(cè)ISL-1陽性間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞密度明顯減低。
　　研究結(jié)論：呼吸內(nèi)胚層的分化發(fā)育與咽前ISL-1陽性間充質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育聚集密切耦聯(lián)。Shh信號(hào)系統(tǒng)在呼吸內(nèi)胚層發(fā)育過程中活躍程度較高，發(fā)育中的呼吸內(nèi)胚層可能作為組織中心，通過Shh信號(hào)通路對(duì)ISL-1陽性細(xì)胞的聚集提供位置信息。呼吸內(nèi)胚層的正常腹側(cè)延伸不但可誘導(dǎo)ISL-1陽性細(xì)胞的正常遷移和流出道的正常分隔，對(duì)流出道的正