小鼠胚胎發(fā)育時(shí)期腦內(nèi)SP和SPR的定位.pdf

1、[背景和目的] P物質(zhì)(SP)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，是由中樞和外周初級(jí)傳入神經(jīng)末梢釋放的一種神經(jīng)遞質(zhì)。哺乳動(dòng)物的SP由前速激肽原(Preprotachykinin，PPT)A基因編碼。PPT-A基因同樣編碼其他速激肽如neurokininA，neuropeptideB等。速激肽受體也被分為速激肽NK1受體，速激肽NK2受體，速激肽NK3受體。速激肽NK1受體與SP有著最強(qiáng)親和力，即P物質(zhì)受體(SPR)。SP與S

2、PR特異結(jié)合后使受體內(nèi)化，通過激活磷脂酶C(PLC)并水解磷酸肌醇(PIP2)生成三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DAG)兩種第二信使發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。 已有的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎時(shí)期腦內(nèi)已有SP表達(dá)，但其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系仍不清楚，而且關(guān)于SPR在小鼠胚胎時(shí)期腦發(fā)育過程中的表達(dá)也未見報(bào)道，因此調(diào)查SP與SPR在小鼠胚胎時(shí)期腦的分布情況及其相互間關(guān)系，可以為進(jìn)一步研究SP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段所起的作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。本研究

3、采用免疫組織化學(xué)染色方法結(jié)合westernblotting半定量方法，使用特異性SP和SPR抗體，觀察SP和SPR在小鼠胚胎發(fā)育時(shí)期腦內(nèi)表達(dá)的變化，推測(cè)胚胎發(fā)育階段SP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所起的作用。 [材料與方法] 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及組織切片制備 分別取E11(胚胎11天)，E13，E15，E17，E19和P0(新生)ICR品系小鼠腦經(jīng)冠狀切面進(jìn)行連續(xù)冰凍切片。 2.酶標(biāo)免疫組織化學(xué) 將冰凍切片分別滴加

4、兔抗SP多克隆抗體和抗SPR多克隆抗體，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，加入抗生物素蛋白—辣根過氧化物酶復(fù)合物，二甲基聯(lián)苯胺呈色觀察。 3.Westernblotting 取E11(胚胎11天)，E13，E15，E17，E19和P0ICR品系小鼠腦組織提取蛋白，行聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜并加抗體作用，二甲基聯(lián)苯胺呈色觀察。 [結(jié)果] 1.在小鼠胚鼠發(fā)育各階段腦中SP和SPR的形態(tài)和分布 E11

5、，SP陽性細(xì)胞只有在上丘腦尾側(cè)段神經(jīng)上皮邊緣層有一定表達(dá)，沒有檢測(cè)到SP陽性纖維。SPR陽性細(xì)胞則在腹側(cè)下丘腦神經(jīng)上皮、腦橋神經(jīng)上皮和扣帶回皮質(zhì)有少量表達(dá)。 E13，SP陽性細(xì)胞開始在新紋狀體和蒼白球處出現(xiàn)，并在隔區(qū)有少量的表達(dá)。SPR陽性細(xì)胞著色較淺，開始在延髓中縫出現(xiàn)致密的SPR陽性纖維與細(xì)胞分布，并在嗅腦、隔區(qū)以及下丘腦有表達(dá)，濃染的陽性細(xì)胞數(shù)量較少，胞體較大呈梭形和三角形，并伴密集且淡染的陽性纖維。 E15，SP

6、陽性細(xì)胞在嗅腦、嗅球、隔區(qū)、梨狀皮質(zhì)和斜角帶有較強(qiáng)的陽性著色，新紋狀體、蒼白球和伏核也有陽性表達(dá)，腦橋區(qū)有三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核陽性著色。在這一時(shí)期SPR的表達(dá)和SP有一定的一致，也在嗅球、隔區(qū)、梨狀皮質(zhì)、海馬、杏仁核和新紋狀體有陽性表達(dá)，延髓則分布更廣，在延髓中縫及腹側(cè)被蓋核有表達(dá)，核內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)量較少，陽性纖維密集且淡染。 E17，觀察到存在從腳內(nèi)核與終紋床核相鄰處發(fā)出一支SP陽性細(xì)胞束，經(jīng)內(nèi)囊和蒼白球內(nèi)側(cè)進(jìn)入紋狀體，陽性細(xì)胞濃染，

7、胞體較大，多呈圓形或梭形，同時(shí)伴有大量陽性終末，杏仁內(nèi)側(cè)核也存在大量SP陽性終末。SP陽性表達(dá)還見于海馬和齒狀回。SPR陽性細(xì)胞和纖維在蒼白球和新紋狀體區(qū)域同樣可見，與SP不同的是其陽性著色主要見于纖維。SPR陽性纖維還可見于杏仁核與腹側(cè)丘腦及下丘腦外側(cè)，在延髓分布于中縫，如中縫背核和藍(lán)斑，中央灰質(zhì)和中央上核。 E19，SP陽性表達(dá)又有增多，在腳內(nèi)核、Forel區(qū)和丘腦后方出現(xiàn)較多SP陽性終末，從杏仁核發(fā)出的纖維索同樣可見，沿內(nèi)

8、囊投射至蒼白球神經(jīng)上皮和紋狀體室管膜下區(qū)，并伴有一定量終末；SP在延髓中縫表達(dá)增多，主要見于上丘，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)，中縫網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，下橄欖核，腹側(cè)被蓋核和藍(lán)斑。SPR陽性則主要見于上丘腦、韁核、腳內(nèi)核、中央灰質(zhì)周圍，在背側(cè)被蓋核及腳間核也有一定表達(dá)。 P0，SP陽性細(xì)胞見于下丘腦，腳內(nèi)核、紋狀體、杏仁核和未定帶，胞體濃染且與大量陽性終末共存。在延髓中縫網(wǎng)狀核，中縫背核也有SP表達(dá)。SPR陽性則主要見于中縫中央灰質(zhì)及腹側(cè)被蓋核，陽

9、性胞體的數(shù)量較少，但可見密集而深染的陽性纖維,SPR還在杏仁核，紋狀體外側(cè)與伏核有一定表達(dá)。總結(jié)結(jié)果見表1和表2。2.Westernblotting結(jié)果 SP從E11就開始有少量表達(dá)，并逐漸開始增多，在E15，E17增加明顯，直到出生；SPR也從E11開始有表達(dá)，直至出生都有穩(wěn)定的表達(dá)。 [結(jié)論] 1.P物質(zhì)(SP)在胚胎發(fā)育早期的新紋狀體等處就有表達(dá)，P物質(zhì)受體(SPR)則開始在延髓中縫有明顯表達(dá)； 2