胚胎心臟流出道、靜脈竇及傳導(dǎo)系的發(fā)生發(fā)育.pdf

1、胚胎心臟發(fā)育過程中，流出道經(jīng)復(fù)雜的分隔和結(jié)構(gòu)重建，參與心包內(nèi)升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干、左右心室流出道及動(dòng)脈瓣膜結(jié)構(gòu)的發(fā)育。流出道發(fā)育和分隔異常將導(dǎo)致永久性動(dòng)脈干，右心室雙流出道，室間隔缺損，主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈易位，法洛氏四聯(lián)癥等多種先天性心臟病。由于轉(zhuǎn)基因或基因敲除后對胚胎發(fā)育影響的復(fù)雜性和不同動(dòng)物的種屬差異，對心臟流出道的正常發(fā)育機(jī)理尚有許多爭議。受精后前8周是人胚心臟流出道發(fā)育、分隔和重建的重要時(shí)期。對人胚心臟流出道發(fā)育和分隔機(jī)理的探討大多局

2、限于較大胚齡的胚胎，缺乏對早期人胚心臟流出道正常發(fā)育和分隔機(jī)理的系統(tǒng)研究。探討胚胎早期心臟流出道的正常發(fā)育和分隔機(jī)理不但是重要的基礎(chǔ)理論研究，也可為探討流出道發(fā)育和分隔異常導(dǎo)致的先天性心臟病的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)，對此類先天性心臟病的預(yù)防和治療有重要意義。 有研究認(rèn)為靜脈竇心肌來自后生心區(qū)的間充質(zhì)，受獨(dú)特的基因調(diào)控，也有著者否認(rèn)哺乳類動(dòng)物心臟發(fā)育過程中靜脈竇結(jié)構(gòu)的存在。以往對人胚心臟發(fā)育的研究多集中在C14期(Carnegies

3、tage14)后較大胎齡的胚胎，此時(shí)靜脈竇已經(jīng)并入右心房，因此這些研究并沒有觀察到靜脈竇的早期發(fā)育。結(jié)蛋白(DES)基因突變導(dǎo)致結(jié)蛋白性心肌病，常伴有不同程度的心臟傳導(dǎo)障礙和心律失常，嚴(yán)重時(shí)引起猝死，其原因不明。 本實(shí)驗(yàn)第一章通過觀察α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、肌球蛋白重鏈(MHC)和Caspase-3(CAS-3)在C10期—4216期(排卵后22±1～37天)人胚心臟、咽中胚層的時(shí)空表

4、達(dá)型及各期心臟和咽中胚層HE染色的形態(tài)學(xué)特征，探討了人胚心臟流出道增長的機(jī)制、心內(nèi)膜墊的發(fā)育及動(dòng)脈囊的分隔。本實(shí)驗(yàn)第二章通過觀察α-SMA、α=SCA和DES在C10～C16期人胚心臟的時(shí)空表達(dá)型，探討了人胚心臟靜脈竇的發(fā)生、分化及傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育。第三章通過觀察α-SMA、α-SCA、MHC、GATA—4、CAS-3、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在胚齡9～12天小鼠胚胎心臟的時(shí)空表達(dá)型探討了小鼠胚胎心臟流出道的縮短機(jī)制。 第一章人

5、胚早期心臟流出道的發(fā)育 取29例C10期—C16期(Carnegiestage10～Carnegiestage16，排卵后22±1～37天)人胚心臟連續(xù)切片，用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重鏈(MHC)和抗活性Caspase-3(CAS-3)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并用HE染色觀察了各期心臟及咽中胚層的形態(tài)學(xué)特征，以探討心包腔背側(cè)臟壁中胚層上皮、咽前間充質(zhì)及動(dòng)脈囊與心肌性流

6、出道發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果顯示：人胚發(fā)育C10期℃15期，由于流出道、動(dòng)脈囊由頸部向胸部移位以及心包腔向胚胎背側(cè)的逐漸擴(kuò)展，使位于原始咽前方間充質(zhì)中的動(dòng)脈囊逐漸突向心包腔內(nèi)，動(dòng)脈囊表面的心包腔背側(cè)臟壁中胚層上皮不斷分化為α-SMA、α-SCA和MHC陽性的流出道心肌細(xì)胞。心包腔臟壁中胚層上皮向心肌細(xì)胞的分化在C16期人胚終止。人胚C10晚期～C12期，流出道遠(yuǎn)端的臟層心包和心包腔的背側(cè)壁為復(fù)層上皮，向壁層心包內(nèi)延伸逐漸變?yōu)閱螌颖馄缴掀?。背?cè)心

7、包于C13期～C15期變?yōu)閱螌由掀?。人胚C10晚期～C13期，流出道遠(yuǎn)端α-SMA和α-SCA表達(dá)可延伸至臟層心包及咽部間充質(zhì)細(xì)胞，流出道逐漸延長。人胚C14期～C15期，流出道明顯延長，其遠(yuǎn)端的臟層心包細(xì)胞增生并遷至流出道，在近流出道心肌細(xì)胞處表達(dá)α-SMA和α-SCA。遷移至流出道動(dòng)脈端前后壁的間充質(zhì)在C15期人胚發(fā)生凋亡，可見流出道心肌細(xì)胞遷入間充質(zhì)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)，取代凋亡的間充質(zhì)細(xì)胞。α-SMA陽性神經(jīng)嵴細(xì)胞在C12期人胚心臟流出道心

8、內(nèi)膜墊中開始出現(xiàn)，隨發(fā)育逐漸增多并在局部聚集形成兩條縱形的螺旋狀走形的嵴。人胚C15期～C16期，動(dòng)脈囊后壁的α-SMA陽性神經(jīng)嵴細(xì)胞向動(dòng)脈囊內(nèi)增生，形成主肺動(dòng)脈隔，將動(dòng)脈囊分隔為心包內(nèi)升主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈干。因此我們認(rèn)為：心包腔背側(cè)臟壁中胚層是人胚心臟第二生心區(qū)，可不斷分化為心肌細(xì)胞，使胚胎心肌性流出道長度增加。細(xì)胞凋亡染色提示并非所有遷入流出道的咽前間充質(zhì)細(xì)胞都可分化為心肌細(xì)胞。流出道遠(yuǎn)端心肌可誘導(dǎo)第二生心區(qū)或稱前心區(qū)細(xì)胞增殖分化為心肌

9、細(xì)胞。α-SMA陽性神經(jīng)嵴細(xì)胞出現(xiàn)在流出道心內(nèi)膜墊和主肺動(dòng)脈隔的時(shí)間不同，提示神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)不同路線遷移至流出道嵴和主肺動(dòng)脈隔。 第二章人胚心臟靜脈竇和傳導(dǎo)系統(tǒng)的早期發(fā)育 用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-SCA)和抗結(jié)蛋白(DES)抗體對29例C10期～C16期(Carnegiestage10℃amegiestage16，排卵后22±1～37天)人胚心臟連續(xù)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示

10、：人胚發(fā)育C12期～213期，系統(tǒng)靜脈匯集形成的靜脈竇出現(xiàn)于心包腔尾端原始橫膈間充質(zhì)中，靜脈竇壁間充質(zhì)細(xì)胞逐漸分化為α-SCA陽性的靜脈竇心肌細(xì)胞。人胚C14期，心包腔的擴(kuò)張使靜脈竇進(jìn)入心包腔內(nèi)，參與了右心房的形成。DES陽性傳導(dǎo)系心肌的分化始于C10期人胚心臟房室管右側(cè)壁，隨發(fā)育逐漸向室間溝心肌擴(kuò)展，發(fā)育為房室傳導(dǎo)系統(tǒng)的希氏束、左右束支及心室腔面的小梁心肌。在心房，DES表達(dá)首先出現(xiàn)于C11期人胚心房背側(cè)壁，在C13期人胚，可見靜脈竇

11、左背側(cè)壁α-SCA、α-SMA、DES陽性心肌帶與左心房底部、房室管背側(cè)壁相延續(xù)，可能這條心肌帶參與了人胚心臟靜脈竇至房室管傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育。人胚發(fā)育C14～C16期，DES強(qiáng)陽性染色從竇房結(jié)經(jīng)左、右靜脈瓣及心房的背、腹側(cè)壁延伸至房室管右側(cè)壁，可能是原始的心房傳導(dǎo)通路。因此我們認(rèn)為，心包腔尾端原始橫膈間充質(zhì)是人胚靜脈竇心肌發(fā)生區(qū)，原始橫膈間充質(zhì)細(xì)胞逐漸分化為心肌細(xì)胞，添加到人胚心管靜脈端，形成心臟靜脈竇心肌。人胚心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)心肌的分化始于

12、房室管，隨心管發(fā)育逐漸向動(dòng)、靜脈端擴(kuò)展，在人胚發(fā)育C16期，已分化為形態(tài)學(xué)清晰可辨的DES陽性胚胎心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。 第三章小鼠胚胎心臟流出道早期并入右心室 用抗α-橫紋肌肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(α-SCA)、抗肌球蛋白重鏈(MHC)抗體標(biāo)記心肌，用抗GATA—4抗體標(biāo)記心肌及其前體細(xì)胞，用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體標(biāo)記早期心肌細(xì)胞，抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體顯示增殖細(xì)胞，用抗人/鼠活性CaSpase-3(CAS-3

13、)抗體檢測凋亡早期細(xì)胞，對胚齡9～12天(胚齡12天分別取8時(shí)、12時(shí)、16時(shí)、20時(shí)胚胎)小鼠胚胎心臟連續(xù)切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)PAP法染色。結(jié)果顯示：①小鼠胚胎心臟流出道于胚齡12天8時(shí)～20時(shí)明顯縮短。②在流出道縮短前及縮短過程中流出道全長均未檢測到CAS-3陽性細(xì)胞。⑦胚齡11天至胚齡12天8時(shí)，動(dòng)脈囊陷入心包腔，GATA—4、α-SCA、α-SMA、MHC染色示流出道遠(yuǎn)端心肌界向心室方向退縮至心包腔內(nèi)，GATA—4染色示流出道

14、遠(yuǎn)端心肌未轉(zhuǎn)分化為大血管壁的細(xì)胞成分，可見第二生心區(qū)來源的間充質(zhì)細(xì)胞不斷分化為心肌細(xì)胞添加在心臟的動(dòng)脈端使流出道延長。④胚齡11～12天，α-SMA陽性心神經(jīng)嵴細(xì)胞逐漸從流出道遠(yuǎn)端遷入，GATA—4、α-SCA、α-SMA、MHC、PCNA染色表明流出道近段心肌不斷增生形成小梁侵入鄰近的流出道嵴內(nèi)，使流出道嵴心肌化而并入右心室；胚齡12天，在近流出道心肌處，可見與流出道心肌相延續(xù)的α-SCA、α-SMA弱陽性間充質(zhì)細(xì)胞流，高倍光鏡下可見

15、其細(xì)胞突起向心肌細(xì)胞延伸或靠近甚至接觸；胚齡12天流出道嵴內(nèi)可見散在的α-SCA、α-SMA、GATA—4陽性細(xì)胞，表明流出道嵴內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞在不斷轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞。因此我們認(rèn)為流出道嵴愈合形成間充質(zhì)性流出道隔前，其近段即在通過心肌化、間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞不斷肌化，使流出道由近向遠(yuǎn)并入了右心室，心肌性流出道逐漸縮短，流出道遠(yuǎn)端界逐漸向心室方向退縮。流出道近段嵴內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化受心肌細(xì)胞直接接觸及釋放的因子的調(diào)節(jié)。心肌