H2O2響應(yīng)光學(xué)納米探針的構(gòu)建及生物傳感.pdf

1、過氧化氫（H2O2）作為活性氧（ROS）家族中的一種主要物質(zhì)，在生物體中承擔(dān)著從毒性物質(zhì)、免疫中間產(chǎn)物再到信號(hào)分子的角色。化學(xué)家們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多光電化學(xué)/傳感裝置，從不同的角度研究了生物體和細(xì)胞中 H2O2的產(chǎn)生，及其在生理和病理學(xué)中的作用，但要實(shí)現(xiàn)生物體中內(nèi)源性 H2O2快速、實(shí)時(shí)、靈敏、原位檢測(cè)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。主要原因是：（1）生物體中氧氣絕大多數(shù)用于有氧呼吸作用，用于產(chǎn)生活性氧的氧氣只占到1%-2%，因此 H2O2在生物體中濃度非

2、常低；（2）生理?xiàng)l件下 H2O2從產(chǎn)生到分解的時(shí)間短，很難進(jìn)行直接定性和定量；（3）定量細(xì)胞因子或增長(zhǎng)因子刺激后信號(hào)通路中產(chǎn)生的 H2O2非常重要，但目前的探針方法限于單色響應(yīng)。盡管現(xiàn)有的含有單硼酸酯識(shí)別位點(diǎn)的探針已經(jīng)能夠成功檢測(cè)內(nèi)源性 H2O2的存在，但許多生理通路中 H2O2含量非常少，難以進(jìn)行定量檢測(cè)。為了解決上述 H2O2檢測(cè)中存在的科學(xué)問題，本論文首先合成含有 H2O2識(shí)別位點(diǎn)苯硼酸酯功能化的部花菁探針，通過優(yōu)化識(shí)別位點(diǎn)對(duì)位的

3、取代基使探針響應(yīng)時(shí)間縮短，實(shí)現(xiàn)對(duì) H2O2的快速檢測(cè)。其次，將前述篩選得到的、性能優(yōu)良的硼酸酯功能化的部花菁探針（BMC3）用作靶向激活位點(diǎn)和雙發(fā)射熒光體，制備了基于雙光子石墨烯量子點(diǎn)（TPGQD420）的比率型探針，TPGQD420-BMC3，實(shí)現(xiàn)對(duì)通路中的 H2O2進(jìn)行比率檢測(cè)和定量。再次，合成基于 H2O2誘導(dǎo)信號(hào)放大的納米膠束探針，PMPC-Bpe@amylose，進(jìn)行靈敏、可視化識(shí)別 H2O2相關(guān)疾病，并成功應(yīng)用在組織活檢中。

4、最后，制備了納米膠束探針，PMPC-Bpe-BHQ2@SQ，利用原位級(jí)聯(lián)信號(hào)放大對(duì)細(xì)胞通路中低含量的 H2O2進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。本論文主要研究?jī)?nèi)容具體如下：
　　1）苯硼酸酯功能化的部花菁探針設(shè)計(jì)及 H2O2的快速識(shí)別與檢測(cè)
　　現(xiàn)有 H2O2識(shí)別探針在響應(yīng)時(shí)間上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了體內(nèi) H2O2的壽命。傳統(tǒng)硼酸酯用于 H2O2的生物學(xué)檢測(cè)中，其探針分子與 H2O2響應(yīng)速度非常慢，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)和定量。因此，我們首先設(shè)計(jì)多種在硼酸

5、酯識(shí)別位點(diǎn)的對(duì)位含有不同取代基的部花菁探針 BMCs。通過密度泛涵理論計(jì)算（DFT）及 BMCs與 H2O2反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng) H2O2識(shí)別位點(diǎn)對(duì)位由給吸電子基團(tuán)變?yōu)閺?qiáng)吸電子基團(tuán)的時(shí)候，響應(yīng)時(shí)間會(huì)從兩小時(shí)左右縮小到十五分鐘。通過取代基優(yōu)化，大大加快了探針的響應(yīng)速度。
　　2）激活式雙光子石墨烯量子點(diǎn)比率成像活體中的 H2O2
　　發(fā)展雙光子納米探針并將其應(yīng)用于成像生物體中各種疾病相關(guān)的物質(zhì)是非常有意義的。然而，

6、現(xiàn)階段納米探針設(shè)計(jì)局限于單色熒光變化，使其難于定量檢測(cè)。為解決這一科學(xué)問題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種雙發(fā)射、雙光子石墨烯量子點(diǎn)探針（TPGQD420-BMC3）并用于 H2O2熒光比成像。為特異性識(shí)別 H2O2并點(diǎn)亮TPGQD420的熒光，利用前述篩選得到的、性能優(yōu)良的硼酸酯功能化的部花菁探針（BMC3）用作靶向激活位點(diǎn)和雙發(fā)射熒光體。在740 nm的雙光子激發(fā)下，TPGQD420-BMC3與 H2O2作用時(shí)呈現(xiàn)出綠到藍(lán)的比率型熒光發(fā)射，其斯托克

7、斯位移為110 nm。經(jīng)過測(cè)定納米探針對(duì) H2O2的檢出限下為0.05μM、檢出范圍為0.2-40μM。隨后通過雙光子比率成像活細(xì)胞和小鼠0-600μm腹腔深層組織中內(nèi)源性 H2O2來驗(yàn)證該方法的可行性。據(jù)我們所知，這是第一次通過對(duì) GQDs的熒光進(jìn)行調(diào)控從而實(shí)現(xiàn)雙發(fā)射、雙光子納米熒光探針構(gòu)建，并將這種探針應(yīng)用于活體生物成像中。
　　3） H2O2誘導(dǎo)的信號(hào)放大用于可視化組織活檢
　　H2O2作為一種潛在的疾病診斷指標(biāo)，它在

8、腫瘤的發(fā)生和原癌基因的轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用。因此，檢測(cè)組織中的 H2O2的量對(duì)疾病識(shí)別非常重要。本節(jié)設(shè)計(jì)、合成了一種 H2O2響應(yīng)的納米聚合物膠束 PMPC-Bpe，并應(yīng)用于組織活檢。PMPC-Bpe包載淀粉，形成 H2O2誘導(dǎo)信號(hào)放大的納米膠束探針，PMPC-Bpe@amylose。當(dāng)探針滴加到組織切片上時(shí)，組織中內(nèi)源性的 H2O2切斷膠束疏水端的識(shí)別位點(diǎn)硼酸酯鍵，使疏水端變?yōu)橛H水性的羧基，打破膠束親疏水平衡使膠束破裂，從而釋放出

9、探針中包裹的大量的淀粉。在遇到外加的 KI/I2，病變組織變藍(lán)。通過變藍(lán)的程度就可以直觀的指示組織中 H2O2的含量，從而實(shí)現(xiàn)潛在指標(biāo)識(shí)別組織活檢和方便快捷對(duì)該潛在指標(biāo)相關(guān)的生理疾病進(jìn)行指示。
　　4）借助生物體原位信號(hào)放大超靈敏檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) H2O2產(chǎn)生
　　H2O2在生理信號(hào)通路中其含量非常少，傳統(tǒng)識(shí)別內(nèi)源性的 H2O2探針很難對(duì)其的產(chǎn)生進(jìn)行準(zhǔn)確的熒光成像及定量。因此，本文設(shè)計(jì)了一種基于原位生物分子級(jí)聯(lián)信號(hào)放大的聚合物膠束

10、納米探針，PMPC-Bpe-BHQ2@SQ，以期實(shí)現(xiàn)可視化NADPH過氧化物酶（Nox）介導(dǎo)的增長(zhǎng)因子信號(hào)通路中 H2O2的產(chǎn)生。由于 BHQ2的吸收與 SQ熒光發(fā)射有很高的光譜重疊度，因此在聚合物的疏水端共價(jià)修飾廣譜猝滅劑 BHQ2后，形成包裹染料 SQ的探針具有極低的背景熒光。在 H2O2存在下切斷膠束疏水端的識(shí)別位點(diǎn)硼酸酯鍵使疏水端變?yōu)橛H水性的羧基，打破膠束親疏水平衡使膠束破裂，從而使包裹在膠束里面的 SQ染料釋放熒光初步增強(qiáng)。接

11、著，如果在生物體復(fù)雜環(huán)境中釋放出 SQ染料，由于這種染料特殊性，它會(huì)與環(huán)境中的生物大分子、蛋白質(zhì)等相互作用，使熒光進(jìn)一步增強(qiáng)。經(jīng)過兩次放大和內(nèi)飾猝滅劑 BHQ2使膠束探針分子對(duì) H2O2的檢出限低至納摩爾級(jí)。從而構(gòu)建出一種在復(fù)雜生物環(huán)境中原位級(jí)聯(lián)信號(hào)放大策略，并通過近紅外熒光成像技術(shù)將該探針成功應(yīng)用在 H2O2的來源過程監(jiān)測(cè)中。據(jù)我們所知，這是第一次設(shè)計(jì)的原位級(jí)聯(lián)信號(hào)放大探針用于超靈敏檢測(cè)生物體刺激通路中的 H2O2，它的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)活體

12、中原位級(jí)聯(lián)信號(hào)放大提供了可能。
　　通過以上探針的設(shè)計(jì)，成功實(shí)現(xiàn)了生物體中 H2O2快速、實(shí)時(shí)和原位檢測(cè)。但 H2O2在通路中的另外一些問題，如：蛋白 Cys殘基氧化和它在氧化還原生物學(xué)中的作用仍然缺乏有力的化學(xué)工具進(jìn)行研究。蛋白亞磺酸的氧化、還原作為一種非常重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方式，因此未來需要設(shè)計(jì)一種新型親核體高活性、高選擇性的研究 H2O2對(duì)蛋白中亞磺酸轉(zhuǎn)化的過程中執(zhí)行的信號(hào)傳導(dǎo)功能。不同信號(hào)傳導(dǎo)過程中都有產(chǎn)生 H2O2的能力