脂肪酶固定化的新方法研究及其應用.pdf

1、脂肪酶是一種水解酶，其突出特點是能夠在油-水界面實施催化功能，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥及手性化合物合成等領域。由于固定化酶具有穩(wěn)定性高、易回收和重復利用等優(yōu)點，一直以來是酶工程的熱點研究領域之一。本文以有機相中酶法拆分消旋烯丙醇酮為對象，以制備高活性、高穩(wěn)定性和高對映體選擇性的固定化脂肪酶催化劑為目標，從固定化載體材料和固定化方法兩個方面研究固定化過程對酶催化性能的影響規(guī)律及作用機制，研究新型的脂肪酶固定化方法。主要內容如下：
　　

2、 (1)以廉價的天然無機材料硅藻土為載體，通過表面改性使之表面連接上不同的疏水性有機官能團，具體包括甲基丙烯酰氧基丙基、辛基、十二烷基、乙烯基等。采用吸附法對Arthrobacter sp.脂肪酶(ASL)進行固定化，研究載體表面性質對固定化酶催化性能的影響。結果表明，經(jīng)疏水表面改性的載體能明顯影響固定化酶的蛋白結合量、活力和穩(wěn)定性，但影響規(guī)律不同。其中，甲基丙烯酰氧基丙基載體所得固定化酶的活力最高，但穩(wěn)定性相對較低，而十二烷基固定化

3、酶的活力和穩(wěn)定性均相對較高。以十二烷基修飾的硅藻土為載體，研究載體疏水性強弱、酶與載體比例以及緩沖液pH等因素對吸附固定化酶性能的影響規(guī)律，并對固定化工藝進行優(yōu)化，最終確定較佳的條件為：載體硅烷化程度0.08g/g載體、酶與載體的比例1/30-1/40、緩沖液為pH9.0，0.03M的Tris-HCl。在吸附的基礎上用戊二醛進一步處理，得到酶聚集體包被法固定化酶。該固定化酶的蛋白結合量、活力及穩(wěn)定性等均較吸附法有明顯提高，總活力回收達到

4、游離酶的8.5倍；E≥200；重復利用20天后，殘余酶活力為原來的76％左右；
　　 (2)以氨丙基三甲氧硅烷和正硅酸乙酯(TEOS)為前體，采用溶膠凝膠法合成氨丙基凝膠，并用戊二醛對其進行活化使其末端帶有游離的醛基。以該凝膠材料為載體分別采用共價結合和酶聚集體包被兩種方法對脂肪酶ASL進行固定化。結果表明，這兩種方法所得固定化酶的穩(wěn)定性明顯升高。其中，基于共價結合的酶聚集體包被法固定化酶在蛋白結合量和酶活力等方面均比單純的共價

5、結合法要高，其總酶活回收為游離酶的84％；E≥200；重復利用9次后，殘余酶活在95％以上；
　　 (3)以非烷烴類的硅烷化試劑甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MAPTMS)和正硅酸乙酯(TEOS)為混合前體采用溶膠凝膠包埋法對脂肪酶ASL，進行固定化，并將之與已報道的烷烴類硅烷前體所制備的包埋固定化酶進行比較。結果表明，該固定化酶在p-NPP水解以及烯丙醇酮轉酯化拆分兩個反應體系中均表現(xiàn)出比其它前體更高的酶活力，并且這些固定化

6、酶活力的高低與凝膠材料的疏水性強弱無直接對應關系；此外，在烯丙醇酮的轉酯化反應體系中，固定化酶的對映體選擇性明顯升高。研究包埋條件對固定化酶催化性能的影響規(guī)律，并對包埋工藝進行優(yōu)化，包括MAPTMS與TEOS的摩爾比，前體水解過程中水的添加量以及酶的添加量等，最終在較佳的條件下固定化酶的總活力回收為游離酶的13.6倍，蛋白負載量為1.4mg/g固定化酶；最佳固定化條件下所得的包埋酶表現(xiàn)出比游離酶更高的穩(wěn)定性，在烯丙醇酮轉酯化反應體系中，

7、固定化酶重復利用60天后殘余酶活力為原來的54％左右；而游離酶重復利用20天后，殘余酶活力為52％；
　　 (4)將溶膠凝膠包埋固定化酶用于烯丙醇酮轉酯化拆分反應體系中，考察了反應溫度、外擴散和內擴散效應、底物濃度和產(chǎn)物濃度等條件對酶活力、選擇性以及反應過程的影響，結果表明上述反應條件的改變對酶的對映體選擇性基本無影響；當搖床轉速大于200r/min時可基本消除外擴散的影響；當固定化酶的粒徑小于1.0mm時可基本消除內擴散限制；

8、當?shù)孜餄舛群彤a(chǎn)物濃度小于1.0mol/l時，酶催化過程無抑制現(xiàn)象存在。在無內外擴散及底物和產(chǎn)物抑制的前提下研究了溶膠凝膠包埋固定化酶催化轉酯化反應拆分烯丙醇酮的動力學。根據(jù)乒乓反應機制建立了動力學模型，反應速率方程為V=Vm[B]/KA+KBA[B]+KAB[B]+KQA[Q]+KBQA[B][Q]KA=1.80mmol/l，KAB=131.84，KBA=5.10，KQA=366.66，KBQA=0.521/mmol。此外，嘗試了一種合

9、成S-烯丙醇酮的新工藝，即以消旋烯丙基呋喃甲醇為起始原料，先經(jīng)過生物拆分得到其S-對映體，然后采用化學重排的方法將S-烯丙基呋喃甲醇轉化為S-烯丙醇酮。采用脂肪酶催化的轉酯化反應對烯丙基呋喃甲醇進行動力學拆分，通過篩選催化劑和有機溶劑，優(yōu)化反應條件，最終建立了較佳的酶法轉酯化拆分烯丙基呋喃甲醇的反應體系，即脂肪酶Rhizopus arrhizus為催化劑，烯丙基呋喃甲醇與乙酸乙烯酯(酰基供體)的摩爾比為1/5，正已烷為溶劑，反應溫度30