構(gòu)建組織工程軟骨中機(jī)械刺激的作用研究.pdf

1、機(jī)械刺激是軟骨組織工程中非常重要的調(diào)控因子。本文以軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，研究了機(jī)械刺激在關(guān)節(jié)軟骨組織工程中的作用。
　　 首先研究了機(jī)械刺激對牛膝關(guān)節(jié)不同軟骨細(xì)胞亞群在PRG4、HAS1、HAS2mRNA表達(dá)和PRG4、透明質(zhì)酸蛋白質(zhì)合成方面的影響。發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞亞群發(fā)生顯型的改變以適應(yīng)其環(huán)境。軟骨細(xì)胞各個亞群之間的相互作用對透明質(zhì)酸的合成有促進(jìn)作用。使用混合亞群的軟骨細(xì)胞，在最佳的機(jī)械刺激條件和生

2、物化學(xué)條件下，可以誘導(dǎo)復(fù)合物表層的細(xì)胞重新分化具有淺表區(qū)細(xì)胞顯型，從而構(gòu)建出較完整的關(guān)節(jié)軟骨層次結(jié)構(gòu)和功能性的軟骨滑液界面。這對于通常以來自整個關(guān)節(jié)的各軟骨細(xì)胞亞群混合細(xì)胞作為種子細(xì)胞的組織工程有重要的意義。
　　 由于軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞存在來源不足，獲取手段復(fù)雜且對患者損傷較大的缺點(diǎn)，繼而研究了以hBMSCs為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建軟骨組織過程中機(jī)械刺激的作用。為了建立體外hBMSCs成軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，研究了纖維蛋白凝膠——聚

3、氨酯支架體系是否支持體外hBMSCs向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。通過測量細(xì)胞的GAG/DNA值，以Real-timePCR測量細(xì)胞的mRNA水平，和組織學(xué)及免疫生物化學(xué)染色方法，對支架培養(yǎng)和微團(tuán)培養(yǎng)進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與微團(tuán)培養(yǎng)體系相比，在最佳接種密度（5x106個細(xì)胞/支架）下，細(xì)胞支架復(fù)合物具有相似的軟骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白合成量GAG/DNA，較高的軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因COL2、AGGmRNA水平，和較低的成骨細(xì)胞標(biāo)志性基因Sp7、ALP、

4、BSP2mRNA水平，同時還具有能夠?yàn)樾律M織的積聚提供空間的優(yōu)點(diǎn)，有利于進(jìn)一步使用生物力學(xué)的手段優(yōu)化體外干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
　　 在不同的外源TGF-β1濃度下，研究了機(jī)械刺激對hBMSCs分化過程的影響，并使用TGF-βⅠ型受體抑制劑LY364947阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究了TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在該過程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明機(jī)械刺激可以誘導(dǎo)纖維蛋白凝膠——聚氨酯支架培養(yǎng)的hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化，前提條

5、件是外源TGF-β濃度較低且培養(yǎng)液中含有地塞米松。由于TGF-β本身可誘導(dǎo)hBMSCs成軟骨細(xì)胞，過高的外源TGF-β濃度下機(jī)械刺激的作用會被覆蓋。機(jī)械刺激通過TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化，TGF-β受體抑制劑可以阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制機(jī)械刺激誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的作用。
　　 對hBMSCs生物支架復(fù)合物施加不同強(qiáng)度和頻率的循環(huán)動壓力和表面剪切摩擦力，以觀察不同力學(xué)環(huán)境下hBMSCs的反

6、應(yīng)．發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激的頻率和幅度可以調(diào)控hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化的過程。在本文所采用的機(jī)械刺激范圍內(nèi)，較高的機(jī)械刺激頻率和較高的動壓力幅度更有利于hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化，更有利于抑制軟骨細(xì)胞肥大化。由此說明在以BMSCs為種子細(xì)胞的軟骨組織工程研究中，對細(xì)胞支架復(fù)合物施加適當(dāng)強(qiáng)度的機(jī)械刺激非常重要。
　　 將視黃酸β受體抑制劑LE135與機(jī)械刺激相結(jié)合，研究其對hBMSCs分化過程的影響。發(fā)現(xiàn)在微團(tuán)培養(yǎng)和支架培養(yǎng)體系中，視黃酸