鴨圓環(huán)病毒ORF2和ORF3基因部分生物學(xué)特性的研究.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的新成員，為共價(jià)閉合的無(wú)囊膜單鏈環(huán)狀DNA病毒。鴨感染DuCV后表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育障礙、生長(zhǎng)停滯，在出殼幾周內(nèi)發(fā)病，生長(zhǎng)停滯和羽毛形狀失常。研究表明DuCV有兩個(gè)主要的功能閱讀框，編碼復(fù)制蛋白R(shí)ep的ORF1和編碼衣殼蛋白Cap的ORF2。序列分析發(fā)現(xiàn)DuCV基因中還存在一個(gè)保守的ORF（命名為ORF3），它位于

2、ORF1的互補(bǔ)鏈上，但其具體功能尚不清楚。由于DuCV不能夠在體外培養(yǎng)，通過(guò)分子生物學(xué)方法揭示其基因的生物學(xué)特性與功能成為研究其致病性的主要手段。
　　 本研究主要進(jìn)行了如下工作:
　　 1、ORF3作為DuCV功能性基因的驗(yàn)證及ORF3蛋白凋亡活性的研究。本研究將DuCV的ORF3基因借助桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)IFA和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，ORF3蛋白存在于感染DuCV的陽(yáng)性鴨體內(nèi)。通

3、過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在感染后24h、48h、72h，表達(dá)ORF3蛋白的重組桿狀病毒引起的Sf9細(xì)胞的凋亡比例明顯大于感染野型桿狀病毒而引起的Sf9細(xì)胞的凋亡比例(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明DuCV的ORF3為一個(gè)功能性O(shè)RF，ORF3蛋白在DuCV的致病性方面可能發(fā)揮著促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡的作用。
　　 2、DuCV的ORF2基因的部分生物學(xué)功能研究。軟件分析發(fā)現(xiàn)DuCV的Cap蛋白N端有兩個(gè)典型的核定位信號(hào)(NLS)。試驗(yàn)中借

4、助桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了帶EGFP的完整的、敲除N端第一個(gè)NLS、敲除第二個(gè)NLS、敲除兩個(gè)NLS以及敲除C端36個(gè)氨基酸的各種Cap蛋白，通過(guò)其在Sf9細(xì)胞中的亞定位來(lái)研究其核定位功能。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除其中的任意一個(gè)NLS，剩下的另一個(gè)NLS均能促使Cap蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，而敲除位于N端36個(gè)氨基酸內(nèi)的兩個(gè)NLS之后，該蛋白則完全喪失了進(jìn)入細(xì)胞核的能力，結(jié)果表明這兩個(gè)假定的NLS均為功能性NLS，并均能單獨(dú)促使Cap蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。在Cap

5、蛋白的DNA綁定功能研究試驗(yàn)中，借助桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)單獨(dú)表達(dá)了完整的、敲除N端第一個(gè)NLS、敲除第二個(gè)NLS、敲除兩個(gè)NLS以及敲除C端36個(gè)氨基酸的各種Cap蛋白，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了純化。純化后的表達(dá)蛋白分別與構(gòu)建的雙拷貝DuCV基因組的DNA在綁定緩沖液中混合后，進(jìn)行了電泳遷移率變動(dòng)分析(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)試驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)完整的、敲除N端第一個(gè)NLS、敲除第二個(gè)NLS

6、、敲除C端36個(gè)氨基酸的Cap蛋白均能使DuCV的DNA出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，而同時(shí)敲除兩個(gè)NLS和蛋白酶消化后的Cap蛋白則喪失其阻滯DNA的功能。這些結(jié)果表明Cap蛋白的DNA綁定區(qū)域與NLS區(qū)域重疊，并且兩個(gè)NLS分別具有DNA綁定能力。
　　 將試驗(yàn)中純化的桿狀病毒表達(dá)的DuCV完整Cap蛋白經(jīng)過(guò)雙氧鈾負(fù)染色后，通過(guò)電子掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DuCV的ORF2編碼的32KD大小的完整Cap蛋白可以自我組裝成內(nèi)部中空的類(lèi)病毒