豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1和ORF2基因的克隆與表達及TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，分為Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)兩個型，其基因組為共價閉合環(huán)狀的單鏈DNA，大小約1.7kb，其中豬工工型圓環(huán)病毒(porcine circovirus 2,PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合(postweaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)的主要病原，它不但可引起斷奶仔豬發(fā)生衰竭、死亡，還與仔豬先天

2、性震顫fcongential tremor，CT)、懷孕母豬流產(chǎn)(reproductive failure)、成年豬皮炎腎炎綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy．syndrome,PDNS，)和呼吸道疾病綜合征(porcinerespiratory disease syndrome,PRDS)有關。這些疾病的廣泛流行嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)，給很多國家和地區(qū)帶來巨大的損失，更為嚴重的是PCV2的感染可以造成

3、免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計。。PCV2已經(jīng)成為嚴重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。因此，對本病毒的研究也逐步深入。我國是養(yǎng)豬大國，對該病及其病原進行研究更具有重要的意義本論文的實驗由兩部分構(gòu)成： 1，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1和ORE2基因的克隆與表達。 根據(jù)GenBank豬圓環(huán)病毒2型基因序列，設計合成兩對特異性引物，對廈門株-1進行PCR擴增，得到ORF1和ORF2基因。將PCR產(chǎn)物酶切后

4、，插入到pET-22b載體中，構(gòu)建原核表達載體pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達，收集菌液進行SDS-PAGE分析。確定重組蛋白主要以包涵體的形式表達，包涵體洗滌溶解后，采用Ni<'2+>離子金屬螯合親和層析柱純化蛋白，逐步透析法進行復性，ELISA實驗證明Rep蛋白和Cap蛋白均能與PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應。 2，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型TaqMan熒光定量PCR

5、檢測方法的建立與初步應用參照GenBank收錄的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)基因組全序列選擇保守區(qū)域設計合成了引物及其探針，并對其進行了篩選；對熒光定量PCR的反應條件進行了優(yōu)化，建立了TaqMan熒光定量PCR檢測方法。用建立的檢測方法對臨床采集的組織病料進行了檢測，并與常規(guī)PCR作對比。結(jié)果顯示，所建立的方法靈敏度可達3.0×10<'3>拷貝λL，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，而與PCV1、CSFV、PRRSV和PRV沒有交反應，具有靈