基于咔唑和三苯胺的熒光探針的合成及應用.pdf

1、最近幾年，采用兩個低能量光子作為激發(fā)光源的雙光子熒光顯微鏡在成像厚的、不透明以及活生物樣本時比傳統(tǒng)的激光共聚焦顯微鏡更有優(yōu)勢。雙光子顯微鏡檢測靈敏度高，沒有圖像失真，低光漂白并且能減少光損傷。正是由于雙光子顯微鏡有上述優(yōu)點，使得生物學家得以在活細胞和活組織中觀察和研究生命過程。熒光顯微技術與熒光探針是相輔相成、相互促進的，新的熒光顯微技術需要新的熒光探針，新的熒光探針促進顯微技術發(fā)展。隨著雙光子顯微鏡的發(fā)展雙光子熒光探針得到不斷發(fā)展，但

2、是缺乏專用的具有大的吸收截面的雙光子探針限制了雙光子熒光顯微鏡的使用，因此開發(fā)新型的雙光子熒光探針具有重要意義。
　　細胞內pH在細胞內許多生理過程中起著至關重要的作用，包括細胞代謝、信號轉導、酶活性、離子轉運、細胞的生長、增殖、凋亡以及自我吞噬。細胞內pH值的異常可能會導致細胞器功能障礙，許多疾病與此相關，如癌癥、中風、阿耳茨海默氏疾病。因此，成像和定量測量活細胞內的pH值對于理解細胞生理功能機理是至關重要的。目前，熒光成像技術

3、研究細胞內的pH值相對于微電極、核磁共振波譜以及光學顯微鏡等方法來說，是一個簡單、靈敏、功能強大的工具。然而，僅僅是測量熒光強度的變化（“熒光開”和“熒光關”），往往會受到光漂白、探針濃度、細胞中探針分布不均勻、不同細胞類型、細胞厚度變化、光穩(wěn)定性、激發(fā)光路長度以及其他環(huán)境因素的影響。比例熒光成像由于利用同一發(fā)射光譜的兩個不同的熒光峰做比例，可以消除大部分外部因素的影響，從而實現(xiàn)自校準，因此比例熒光探針可以用于復雜體系檢測pH值變化。<

4、br>　　1、本文設計合成了一種具有高選擇性、高膜透性、低毒性、高生物相容性能夠用于活細胞和活組織成像并能定量測量活細胞pH值的單/雙光子熒光探針。通過Heck反應制備了基于咔唑衍生物有機小分子單/雙光子pH比例熒光探針(PCBT)，并通過核磁共振、高分辨質譜確定其分子結構。首先通過研究PCBT在不同極性溶劑中的熒光光譜變化，確定其熒光發(fā)射是ICT過程，這種熒光發(fā)射過程的分子適合作為比例熒光探針。其次，通過研究在酸堿條件下的線性吸收和熒

5、光發(fā)射的變化，確定PCBT對于pH值的變化有響應，通過pH滴定實驗，在體外驗證了PCBT適合作為單/雙光子pH比例熒光探針。再次，由于氮原子容易與眾多金屬離子和陰離子結合，因此我們研究了PCBT對于一些細胞中常見的陰/陽離子的選擇性，證明PCBT對于其他離子響應很少，對于H+有非常高的選擇性。
　　通過細胞毒性研究表明PCBT對于SiHa細胞具有低毒性，高生物相容性的特點。利用單/雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)PCBT染色的SiHa

6、和HeLa細胞，表明PCBT可以用于細胞單/雙光子顯微成像。DIC圖像證明細胞具有完整的細胞結構，貼壁生長，活性良好。通過研究來自于不同光學窗口的熒光圖像的比例，證明PCBT可以在單/雙光子激發(fā)下對細胞內不同區(qū)域的pH值比例成像。利用細胞內外pH值平衡以后的細胞通過顯微熒光成像得到不同pH值細胞的比例熒光圖像，將這些圖像與正常細胞比例熒光圖像的偽色彩做對比，可以定量測量細胞內pH值。最后研究了活組織染色濃度、染色時間對于雙光子熒光成像深

7、度的影響。實驗證明PCBT用于肝臟和腎臟活組織切片雙光子熒光顯微成像深度可以達到66μm和42μm，經(jīng)過歸納總結得出PCBT用于活組織成像最低濃度不能低于20μM染色時間最好是120分鐘以上，提高染色濃度能顯著提高成像深度。
　　2、設計、合成了三苯胺和咔唑衍生物(APPI、ECPI)用于定位細胞中的線粒體，通過研究其在不同極性溶劑中的熒光光譜變化，確定其熒光發(fā)射是PET過程。研究兩個分子在酸堿條件下的發(fā)射光譜排除了兩個分子對pH

8、值的變化有響應。通過MTT實驗研究表明其對于SiHa細胞具有低毒性，高生物相容性的特點。利用單光子激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)APPI、ECPI染色的SiHa細胞，得到清晰艷麗的活細胞顯微熒光圖像。利用MTR和APPI、ECPI復染活SiHa細胞，通過計算得到APPI、ECPI和MTR共定位系數(shù)高達0.989、0.995，重合系數(shù)高達0.92和0.81，證明APPI、ECPI就是線粒體探針。
　　3、設計合成了基于咔唑和吡啶衍生物的熒光

9、染料，研究其在不同pH值緩沖溶液中的光物理性質。通過MTT實驗證明這些分子對于細胞具有低毒性高生物相容性的特點。通過活細胞成像試驗說明這些咔唑和三苯胺衍生物均可用于活細胞成像，由于ECP和CP兩個分子本身具有雙熒光發(fā)射，用其來自于不同通道的熒光做了比例成像，結果顯示這兩個分子能夠在活細胞中比例成像，其偽色彩可以成像細胞質中的不同位置，結合分子結構，推測可能與細胞中氫離子分布有關。這些研究為以后利用咔唑和三苯胺衍生物設計活細胞熒光探針打下