水產(chǎn)品中丙酸睪酮?dú)埩魴z測方法的研究.pdf

1、丙酸睪酮作為一種人工合成的睪酮衍生物，是一種甾類蛋白質(zhì)同化激素，因其具有提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動物生長、提高產(chǎn)量等作用而被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。然而水產(chǎn)品中殘留的丙酸睪酮對人體健康存在影響生長發(fā)育等很多危害，甚至有潛在的致癌性，已被許多國家限制或禁止其在食用性動物養(yǎng)殖中使用。但在利益的驅(qū)動下，其仍然存在被濫用的問題，因此，針對水產(chǎn)品中的丙酸睪酮建立可靠的檢測方法進(jìn)行監(jiān)控是一項(xiàng)十分必要的措施。本文通過氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法兩種檢測手

2、段對水產(chǎn)品中丙酸睪酮?dú)埩舻臋z測方法進(jìn)行了研究。
　　 1、通過對樣品前處理方法、衍生化技術(shù)、儀器測定條件等方面進(jìn)行研究，首次建立了針對水產(chǎn)品肌肉組織中以氘代諾龍-D3為內(nèi)標(biāo)測定丙酸睪酮留量的氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)方法，并對丙酸睪酮三甲基硅烷化衍生產(chǎn)物質(zhì)譜測定時的裂解過程進(jìn)行了初步的解譜推測。均質(zhì)后的樣品中加入內(nèi)標(biāo)諾龍-D3和飽和氯化鈉溶液，用叔丁基甲醚超聲振蕩提取，經(jīng)過-80℃冷凍20min脫脂，Silica固相萃取柱凈化

3、和柱前三甲基硅烷化衍生后，進(jìn)行GC/MS測定。根據(jù)丙酸睪酮和內(nèi)標(biāo)衍生物保留時間、主要特征離子及其相對豐度進(jìn)行定性；在選擇離子監(jiān)測(SIM)模式下，根據(jù)丙酸睪酮和內(nèi)標(biāo)衍生物定量離子質(zhì)量色譜圖的峰面積比值，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙酸睪酮濃度在0.005μg/mL～0.2μg/mL的范圍內(nèi)和丙酸睪酮與內(nèi)標(biāo)諾龍-D3衍生物定量離子峰面積比值呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=26.81X-0.005，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997；方法

4、定量檢測限為2μg/kg，滿足藥物殘留檢測的要求；當(dāng)添加水平為1.0～10.0μg/kg時，回收率為74.1％～99.5％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0％～8.3％，具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性。通過對鰻鱺、甲魚兩種樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)說明該方法適用于高脂肪含量的鰻鱺，而不適合甲魚樣品。通過對市場上8種魚貝蝦類樣品的抽檢，證明該方法可對樣品實(shí)現(xiàn)靈敏、準(zhǔn)確的定性定量分析，而第三方實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果，進(jìn)一步證明本方法是可靠的，滿足對實(shí)際水產(chǎn)品的檢測及監(jiān)控的

5、要求。
　　 2、通過對樣品提取凈化條件、流動相組成和梯度、色譜質(zhì)譜參數(shù)等方面的探索，首次建立了不同水產(chǎn)品肌肉組織中以氘代同位素諾龍-D3為內(nèi)標(biāo)測定丙酸睪酮?dú)埩袅康囊合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法；同時通過對HPLC/MSQTOF色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了采用飛行時間質(zhì)譜對丙酸睪酮進(jìn)行確證性定性檢測的方法。均質(zhì)的樣品中加入氘代內(nèi)標(biāo)諾龍-D3，采用叔丁基甲醚作為提取溶劑，用先振蕩后超聲再振蕩的方式進(jìn)行提取，離心后取上

6、清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-0.1％甲酸水溶液(9:1)復(fù)溶，在-80℃條件下冷凍30min，然后高速冷凍離心凈化，過0.22μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC-MS/MS測定分析。根據(jù)丙酸睪酮和內(nèi)標(biāo)諾龍-D3的保留時間、主要特征子離子及其相對豐度進(jìn)行定性：多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式下，根據(jù)丙酸睪酮和內(nèi)標(biāo)諾龍-D3定量離子的峰面積比值，采用內(nèi)標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙酸睪酮與內(nèi)標(biāo)諾龍-D3的定量離子峰面積比值和丙酸睪酮與內(nèi)標(biāo)物的濃度比值在0.5

7、 ng/mL～100ng/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.9964X-0.0356，相關(guān)系數(shù)R2為0.9989。方法定量檢測限為0.5μg/kg，可以滿足藥物殘留檢測的要求；當(dāng)在水產(chǎn)品中的添加水平為0.5～20μg/kg時，回收率為89.1％～104.5％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3％～5.5％，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。該方法前處理簡單快捷，對樣品檢測的靈敏高、準(zhǔn)確性好，滿足水產(chǎn)品的檢測及監(jiān)控的要求，可用于樣品定量檢測或確證性檢測