馬鈴薯蛋白水解物在水包油乳狀液中的抗氧化作用及機(jī)理研究.pdf

1、水包油(O/W)乳狀液是廣泛存在于食品中的兩相分散體系。因油脂氧化而導(dǎo)致食品品質(zhì)下降也是這類食品普遍存在的問題。已經(jīng)有研究表明在乳狀液中加入具有抗氧化活性的蛋白水解物可以抑制乳狀液中油脂氧化。但是具有抗氧活性的蛋白水解物在乳狀液中的分布及其對(duì)乳狀液氧化穩(wěn)定性影響的機(jī)理尚未得到闡明。為了更好的設(shè)計(jì)乳狀液抗氧化的策略來提高產(chǎn)品氧化穩(wěn)定性，有必要對(duì)具有抗氧活性的蛋白水解物在乳狀液中的分布與油脂氧化抑制作用之間關(guān)系的機(jī)理進(jìn)行研究。同時(shí)，馬鈴薯蛋

2、白作為馬鈴薯淀粉工業(yè)的副產(chǎn)物，由于功能性質(zhì)差而附加值較低。通過的酶解的手段改善其功能性質(zhì)，將其開發(fā)成具有抗氧化活性的蛋白水解物則可以拓寬其使用范圍。因此，本論文的研究對(duì)于進(jìn)一步闡明具有抗氧化活性的蛋白水解物在乳狀液中的抗氧化機(jī)理有著重要的學(xué)術(shù)意義。同時(shí)，對(duì)提高馬鈴薯蛋白的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)品附加值有一定的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 論文首先研究了馬鈴薯蛋白水解物對(duì)O/W乳狀液乳化穩(wěn)定性及氧化穩(wěn)定性的影響。采用Acalase水解馬鈴薯蛋白，制備得

3、到具有抗氧化活性的馬鈴薯蛋白水解物，將蛋白水解物加入到Tween20為乳化劑的大豆油O/W乳狀液(油含量10％,pH7.0)中，采用烘箱氧化法(37℃)，通過定期測(cè)定乳狀液在氧化過程（0-14天）中過氧化值(POV)和丙二醛反應(yīng)物(TBARS)的變化，考察馬鈴薯蛋白水解物了對(duì)乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明對(duì)于以Tween20和馬鈴薯蛋白水解物混合物為乳化劑制備得到的乳狀液，在37℃下貯藏7天后，和未添加馬鈴薯蛋白水解物的樣品相比，馬鈴

4、薯蛋白水解物對(duì)乳狀液中POV和TBARS的抑制率最高分別可達(dá)到53.4％和70.8％(P＜0.05)。馬鈴薯蛋白水解物不論是在乳狀液均質(zhì)前加入還是在乳狀液均質(zhì)后加入，都能起到了抑制乳狀液中油脂氧化的作用，但是抑制機(jī)制不同，馬鈴薯蛋白水解物在均質(zhì)前加入可以更好抑制過氧化物的形成，而馬鈴薯蛋白水解物均質(zhì)后加入則可以更好抑制丙二醛類物質(zhì)的形成。上述結(jié)果暗示了馬鈴薯蛋白水解物在乳狀液中的抗氧化機(jī)制與其在乳狀液的分布有關(guān)。
　　 接著進(jìn)一

5、步研究了馬鈴薯蛋白水解物的分子量和極性對(duì)于乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響。通過凝膠色譜分離和硫酸銨沉淀兩種方法對(duì)馬鈴薯蛋白水解物進(jìn)行了分級(jí)，分別得到了不同分子量和不同極性的馬鈴薯蛋白水解物組分。通過測(cè)定ABTS+自由基清除能力和金屬離子螯合能力分析了這些組分的抗氧化性質(zhì)。同時(shí)，以正己醛和TRARS為指標(biāo)，采用烘箱氧化法(37℃)考察了具有不同分子量和不同極性的馬鈴薯蛋白水解物組分對(duì)Tween20為乳化劑制備得到的大豆油O/W乳狀液（油含量10％

6、,pH7.0）氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，不同性質(zhì)的馬鈴薯蛋白水解物組分的自由基清除能力與其在乳狀液中抗氧化能力有不一致性，凝膠色譜分離得到的低分子量組分Peak3(分子量低于1043Da)和50％硫酸銨沉淀得到的組分P50表現(xiàn)出了相對(duì)較好的自由基清除活性和抑制油脂氧化能力。
　　 然后采用制備型液相色譜對(duì)Peak3和P50進(jìn)行了進(jìn)一步純化，對(duì)純化得到的組分中ABTS+自由基清除能力的組分采用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPL

7、C-MS/MS)對(duì)其中的活性多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并將鑒定得到的多肽與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中馬鈴薯蛋白的序列進(jìn)行了相似性匹配。結(jié)果表明，從組分Peak3中分離得到四個(gè)與馬鈴薯蛋白中主要蛋白Patatin序列片段相匹配的多肽，分別為Thr-Tyr,Tyr-Phe-Glu,Tyr-Ser-Thr-Ala和Asn-Tyr-Lys-Gln-Met。從組分P50鑒定得到了兩個(gè)與馬鈴薯蛋白序列相匹配的多肽，分別為Ser-Ser-Glu-Phe-Thr-Tyr

8、和Ile-Tyr-Leu-Gly-Gln。這兩個(gè)多肽序列分別存在與馬鈴薯蛋白metallocarboxypeptidase inhibitor和lipoxygenase1中。通過制備型液相色譜對(duì)從組分Peak3中分離得到的組分P3F5進(jìn)行了進(jìn)一步純化，利用UPLC-MS/MS確定了存在于Patatin中的三肽Tyr-Phe-Glu為高活性的抗氧化肽。
　　 同時(shí)，采用離心法分析了馬鈴薯蛋白水解物在乳狀液中的分布，結(jié)果表明有8-1

9、5％的馬鈴薯蛋白水解物分布在了乳狀液的界面上。隨著乳狀液的pH從3調(diào)到7，乳狀液的ζ-電位有了明顯的增加(＜0.05)。通過常規(guī)透射電鏡對(duì)乳狀液進(jìn)行表征，結(jié)果表明乳狀液中油脂氧化的抑制和分布在水相中乳狀液顆粒周圍的馬鈴薯蛋白水解物的化學(xué)作用和物理屏蔽機(jī)制有關(guān)。利用原子力顯微鏡的高度成像模式和相位成像模式對(duì)乳狀液形貌進(jìn)行的表征，結(jié)果表明加入馬鈴薯蛋白水解物作為輔乳化劑的乳狀液中油脂可以得到更好地分散。而且，和Tween20為單一乳化劑制備

10、的乳狀液相比，分布在脂肪球界面膜上的馬鈴薯蛋白水解物會(huì)改善界面的狀況。通過激光共聚焦掃描顯微鏡和冷凍透射電鏡對(duì)乳狀液脂肪球界面膜進(jìn)行了進(jìn)一步的表征。從微觀結(jié)構(gòu)上直觀地證明了馬鈴薯蛋白水解物在界面膜上的分布，在超微觀結(jié)構(gòu)上顯示了界面膜的形態(tài)為非連續(xù)分布的棒狀結(jié)構(gòu)。
　　 最后，通過離心分離結(jié)合有機(jī)溶劑提取的方法得到了界面上的多肽。采用G15凝膠色譜對(duì)這部分多肽進(jìn)行了進(jìn)一步分離，按時(shí)間(2min)收集并得到了一系列組分。通過固相萃取

11、柱脫除組分中的Tween20后，采用超高液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)其中部分ABTS+自由基清除能力相對(duì)較好的組分中的多肽進(jìn)行了分離鑒定。對(duì)得到的多肽的性質(zhì)分析表明，得到的多肽是由2-7個(gè)氨基酸組成的短肽，分子量分布在200-800之間。亮氨酸/異亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸在這些多肽中出現(xiàn)的概率較高。通過多肽的序列分析多肽的親疏水性較氨基酸組成分析的方法更合理。
　　 以上的結(jié)果暗示馬鈴薯蛋