應用MLVA對中國人群幽門螺桿菌的基因分型研究.pdf

1、目的：
　　 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H. Pylori)是一種螺旋狀、微需氧、革蘭陰性桿菌，定植于人胃黏膜表面。全球約有50％的人口感染H. Pylori，尤其在發(fā)展中國家，其感染率達50％～70％。
　　 人類是H. Pylori 唯一的天然宿主，大量研究表明H. Pylori 感染與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關。人類對H. Pylori 普遍易感,

2、但感染后的癥狀輕重緩急各不相同,表現(xiàn)出明顯的致病性差異，輕者可無癥狀長期攜帶，重者可引起慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍甚至腫瘤。其原因不僅與宿主的遺傳易感性相關可能更與菌株的毒力強弱相關。
　　 H. Pylori 有其獨特的遺傳變異性和種內多樣性，等位基因的序列多態(tài)性遠遠高于其它細菌。目前對H. Pylori 進行的基因分型主要依據(jù)幾種與其感染密切相關的蛋白質或管家基因的多態(tài)性，然而這些傳統(tǒng)分型方法都存在著各自的局限性，目前對于H.

3、Pylori的分型方法還沒有一個公認的金標準。
　　 利用基因組中特定位點上可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(variable number tandem repeatsequence，VNTR)進行基因分型是生物中常用的方法。VNTR位點是細菌基因組中的串聯(lián)重復序列，重復序列在不同菌株間重復次數(shù)不同，而重復序列的大小及兩側的序列高度保守。因此可通過比較VNTR位點重復次數(shù)的數(shù)目來區(qū)分不同的菌株。多個VNTR位點的基因分型稱為多位點串聯(lián)重復

4、單元基因分型方法即Multi-VNTR (Multi-locusvariable-number tandem-repeats analysis, MLVA)。
　　 MLVA 具有很高的分辨能力，既可用于流行病學研究，也可用于分子進化學研究，已廣泛應用于多種細菌的基因分型研究中，然而尚未在H. Pylori中得到應用。本研究首先分離培養(yǎng)中國主要地區(qū)與民族的H. Pylori，然后采用MLVA對不同來源的幽門螺桿菌菌株進行基因型檢

5、測與分析，研究MLVA在幽門螺桿菌基因分型中的應用和MLVA基因型與菌株分離來源的地區(qū)、民族、疾病等之間的相關性。
　　 方法：
　　 1.對H. Pylori的常規(guī)分離培養(yǎng)方法根據(jù)高原地區(qū)高海拔、低氣壓、低氧含量等環(huán)境特點（西藏拉薩）進行改進，并將改進的分離培養(yǎng)方法（減量法：打開一袋產(chǎn)氣袋（約18克）去除7克后置37℃微需氧環(huán)境進行培養(yǎng)；加氧法：向培養(yǎng)盒內加入0.224升氧氣以補足高原缺氧量，然后，置37℃微需氧環(huán)境進

6、行培養(yǎng)；加壓加氧法：加氧法操作后，將盒蓋頂端的充氣閥與1.01×105KPa的氮氣閥相聯(lián)，氣流穩(wěn)定后關閉氣閥，置37℃微需氧環(huán)境進行培養(yǎng)。）與常規(guī)法（將接種過的培養(yǎng)基放入2.5L培養(yǎng)盒內，打開一袋微需氧產(chǎn)氣袋立即放入盒內，置37℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)2～5天。）進行比較。探討適合高原環(huán)境特點的H. Pylori分離培養(yǎng)方法，收集高原地區(qū)的菌株。同時用常規(guī)法收集其它7個不同地區(qū)(北京、重慶、上海、內蒙、杭州、石家莊、廣州等)、不同病種(胃癌、消

7、化性潰瘍、慢性胃炎和無癥狀攜帶者)及主要民族(藏族、蒙族、和漢族)的H.Pylori菌株。
　　 2.參照其它細菌如結核分枝桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏桿菌等MLVA基因分型的選點原則及H. Pylori基因組自身的特點制定了選點原則如下：①重復序列的重復片段≥10bp; ②連續(xù)兩個重復片段的堿基突變率≤5％; ③每個重復位點在三株參照株之間(26695, H. pyloriAG1, J99)至少存在兩個等位基因。按照此選點原則

8、篩選VNTR位點并設計引物，對不同地區(qū)來源的20株H. Pylori進行基因擴增，電泳圖譜分析，觀察擴增條帶是否存在差異以及差異程度的大小，進一步篩選具有較好分辨力的VNTR位點。
　　 3.應用篩選的VNTR 位點對不同地區(qū)、不同消化系疾病、不同民族來源的202株H. Pylori菌株進行基因擴增、電泳,應用UVB-紫外凝膠分析儀或Bio-Numerics 5.1分析軟件，讀出各個擴增片段的大小，根據(jù)設計引物時兩端保守序列的大

9、小，每個重復單元的長度計算出各個重復片段的重復次數(shù)。應用Bio-Numberics 軟件對重復次數(shù)數(shù)據(jù)進行聚類分析和最小生成樹分析，研究MLVA基因型與菌株來源的地區(qū)、民族、疾病之間的相關性。
　　 結果：
　　 1.建立了適合高海拔、低氣壓、低氧含量等環(huán)境特點的H. Pylori分離培養(yǎng)方法，收集了35株高原地區(qū)（西藏）的H. Pylori菌株。應用H. Pylori的常規(guī)分離培養(yǎng)方法收集了廣東和石家莊地區(qū)H. Pyl

10、ori菌株各12株，北京菌株10株，杭州菌株26株，上海菌株10株，內蒙菌株43株。與日本東京大學交換了15株日本H. Pylori菌株，共計實驗菌株202株。
　　 2.根據(jù)制定的選點原則篩選出了20個VNTR位點，通過預實驗進一步鑒定出12個多態(tài)性較好的位點，分別為VNTR-180，VNTR-263，VNTR-614，VNTR-557，VNTR-607，VNTR-1801，VNTR-2181，VNTR-2457，VNTR-2

11、576，VNTR-5062，VNTR-5282，VNTR-5581。
　　 3.應用12個VNTR位點對202株H. Pylori臨床分離株進行了基因分型，取得了較好的分型效果，202株菌株可以完全被鑒別。應用Bio-Numberics軟件對重復次數(shù)數(shù)據(jù)進行聚類分析和最小生成樹分析，聚類分析結果顯示，202株菌株聚集成5個基因亞型，同一個地區(qū)來源的菌株表現(xiàn)出了相同或相似的基因型，并聚類在一起，表明了來自同一個地區(qū)的菌株具有明顯的

12、地區(qū)聚集性。對118株4個不同民族(藏族、蒙族、漢族、大和民族)菌株的VNTR位點數(shù)據(jù)進行了最小生成樹分析，結果表明，不同來源的菌株在民族間具有明顯的聚集趨勢，四個民族來源的菌株主要聚集成了4個亞群，每個民族主要聚集于一個亞群。
　　 4.在202株H.pylori臨床菌株中，非潰瘍性消化不良、慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌菌株分別占14.9％, 55.9％, 25.2％和4.0％，在基因型與疾病的相關性研究中，未發(fā)現(xiàn)與疾病的明