幽門螺桿菌對(duì)促凋亡基因PUMA表達(dá)的影響.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植在人胃粘膜上革蘭染色陰性的微需氧菌,其感染是誘發(fā)人胃粘膜病變的主要因素之一,在世界范圍內(nèi)約有50％人群感染月H.pylori。世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌源,但其與胃癌發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。
　　 PUMA(P53正向細(xì)胞凋亡調(diào)控因子)是新近發(fā)現(xiàn)的bcl-2家族BH-3亞家族中的促凋亡成員,在p53依賴和非依賴途徑的細(xì)胞凋亡啟動(dòng)與腫瘤發(fā)生過程中都發(fā)揮著

2、重要作用。該基因定位于19q,cDNA全長1.9 kb,編碼一個(gè)全長為193個(gè)氨基酸殘基的蛋白。PUMA基因具有4個(gè)外顯子(1a或1b,2,3,4)和三個(gè)內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄后形成四種不同的剪接體(PUMA-α,-β,-γ及-δ)。目前PUMA四種剪接體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)分布及功能尚不清楚。
　　 本論文的目的是研究PUMA基因四種剪接體在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn),以及不同H.pylori菌株(潰瘍及胃癌菌株)對(duì)胃癌細(xì)胞(BGC-82

3、3)及人正常胃上皮細(xì)胞(GES-1)中PUMA基因四種剪接體表達(dá)變化的影響,并初步探討H.Pylori對(duì)PUMA基因的作用機(jī)制以及與胃癌發(fā)生的關(guān)系。
　　 方法:1.利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測胃癌組織、癌旁組織及不同胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中四種剪接體的mRNA表達(dá)水平,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序分析。2.從人胃粘膜組織中分離不同的幽門螺桿菌菌株,分別與BGC-823或GES-1細(xì)胞共培養(yǎng),提取細(xì)胞總

4、RNA,在不同時(shí)間點(diǎn)測定PUMA基因四種剪接體表達(dá)的變化。3.MTT法分析H.pylori刺激后細(xì)胞增殖抑制情況。
　　 4.應(yīng)用JC-1熒光染料法檢測不同H.Pytori菌株刺激BGC-823或GES-1細(xì)胞后線粒體膜電位的變化。5.同時(shí),采用熒光定量PCR法檢測p53基因表達(dá)的變化,探討與PUMA四種剪接體在H.Pylori刺激后表達(dá)變化的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:1.PUMA四種剪接體經(jīng)PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行克隆測序后與G

5、enBank中序列進(jìn)行同源性比較,證實(shí)為PUMA-α,-β,-γ及-δ,同源性均在99％以上。PUMA-α和-β在癌旁組織中表達(dá)陽性,但在癌組織中表達(dá)難以檢測,差異顯著(P<0.05)；PUMA-γ和-δ在癌旁及癌組織中均可見表達(dá),且在癌旁組織中的表達(dá)量顯著高于癌組織(P<0.05)。PUMA-α,-γ及-δ在胃癌不同分化程度的細(xì)胞系BGC-823(低分化)及SGC-7901(中分化)中均有表達(dá),但兩細(xì)胞系間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而PUMA-β

6、在BGC-823中的表達(dá)明顯高于SGC-7901細(xì)胞(P<0.05)。2.兩種H.Pytori菌株刺激BGC-823細(xì)胞后與未刺激組相比,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(3 h、6 h及9 h)PUMA剪接體mRNA相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05),但四種剪接體表達(dá)變化各有特點(diǎn):PUMA-β在兩種H.Pylori菌株刺激后mRNA都難以檢測到；在潰瘍菌株刺激組,PUMA-α在6 h時(shí)下調(diào)最顯著,-γ在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量降低的百分比無明顯差別；而-δ在9 h時(shí)

7、下調(diào)較明顯。而在胃癌菌株刺激組,-α在3 h,-γ在3 h、6 h,-δ在9 h未檢測到表達(dá)。3.兩種H.Pylori菌株刺激GES-1細(xì)胞后結(jié)果顯示:潰瘍型刺激后PUMA剪接體在初期表達(dá)上調(diào),9 h時(shí)表達(dá)又下調(diào)。而胃癌型的H.Pytori作用于GES-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,在3 h時(shí)PUMA剪接體表達(dá)下調(diào),而6 h,9h時(shí)又有恢復(fù)趨勢。4.MTT法檢測H.Pytori刺激前后BGC-823或GES-1細(xì)胞增殖抑制情況顯示兩種菌株

8、對(duì)BGC-823細(xì)胞均有增殖作用；而對(duì)于GES-1細(xì)胞而言,潰瘍菌株先誘導(dǎo)凋亡后又促進(jìn)增殖。胃癌菌株則促進(jìn)GES-1細(xì)胞增殖。5.JC-1熒光染色法檢測提示兩種菌株對(duì)BGC-823或GES-1細(xì)胞均促進(jìn)增殖。6.熒光定量PCR結(jié)果顯示與未刺激組相比,不同H.Pylori菌株刺激BGC-823細(xì)胞9 h后p53基因表達(dá)均顯著性上調(diào)(P<0.01),而3 h,6 h時(shí)卻無明顯變化；兩種菌株刺激GES-1細(xì)胞后與未刺激組相比,p53基因在3個(gè)

9、時(shí)間點(diǎn)表達(dá)都上調(diào)(P<0.05),且有較好的時(shí)效關(guān)系(r潰瘍型=-0.978,r胃癌型=0.9413,P<0.01)。
　　 結(jié)論:1.PUMA四種剪接體在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào),與癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)；PUMA-β的表達(dá)還可能與細(xì)胞的分化程度有關(guān)。2.在BGC-823細(xì)胞中,H.Pylori可促進(jìn)細(xì)胞增殖,并顯著下調(diào)PUMA剪接體的表達(dá),這種下調(diào)作用與p53無關(guān)。PUMA的表達(dá)與細(xì)胞增殖負(fù)相關(guān)。3.潰瘍型H.Pytori對(duì)GES-1

10、細(xì)胞先誘導(dǎo)凋亡后又促進(jìn)增殖；PUMA剪接體的變化與細(xì)胞增殖變化一致；p53在刺激早期表達(dá)迅速上調(diào),之后表達(dá)逐漸下降,與PUMA具相似的趨勢,提示在胃上皮細(xì)胞中PUMA的表達(dá)可能依賴于p53的表達(dá)水平。4.胃癌型H.Pylori對(duì)GES-1細(xì)胞具有促增殖作用；對(duì)PUMA的表達(dá)先抑制后又恢復(fù),而對(duì)p53的表達(dá)則有促進(jìn)作用。在胃上皮細(xì)胞中,胃癌型H.Pylori對(duì)PUMA剪接體的作用可能與p53有關(guān)。綜上所述,不同類型H.pylori對(duì)細(xì)胞的