重組大腸桿菌生產(chǎn)核黃素和β-胡蘿卜素的途徑構(gòu)建與改造.pdf

1、本研究通過核黃素合成途徑的構(gòu)建，中心碳代謝的改造及發(fā)酵條件的優(yōu)化的策略，研究了大腸桿菌生產(chǎn)核黃素的代謝能力；其次，利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)，在大腸桿菌的基因組上整合β-胡蘿卜素合成基因，對(duì)MEP途徑、中心碳代謝途徑進(jìn)行組合改造，獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌。
　　首先，考察大腸桿菌自身核黃素合成基因在不同拷貝數(shù)質(zhì)粒中表達(dá)對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響，并與枯草芽孢桿菌核黃素合成基因比較。通過發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌自身

2、核黃素合成基因在高拷貝質(zhì)粒過表達(dá)更有利于核黃素的積累。
　　5-磷酸核酮糖是核黃素合成的重要前體物。為了提高5-磷酸核酮糖的供給，本文對(duì)氧化磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑以及ED途徑(Entner-Doudoroff Pathway)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)來源于谷氨酸棒桿菌的突變型zwf243和gnd361基因不能有效的提高核黃素產(chǎn)量；進(jìn)一步過表達(dá)大腸桿菌內(nèi)源pgl基因能夠進(jìn)一步提高核黃素的產(chǎn)量；敲除糖酵解途徑中pgi基因構(gòu)

3、建RF02S，使得核黃素的產(chǎn)量提高了72.4％，進(jìn)一步失活ED途徑使得核黃素的產(chǎn)量提高41.8%；過表達(dá)acs基因能夠有效的降低副產(chǎn)物乙酸的積累，對(duì)核黃素的產(chǎn)量沒有明顯的影響。最終獲得工程菌RF05S在以10g/L葡萄糖為底物的LB培養(yǎng)基中能夠積累585.2±13.6mg/L核黃素。
　　為了防止過多的核黃素轉(zhuǎn)化為FMN和FAD，在不影響菌體生長(zhǎng)的情況下提高核黃素的產(chǎn)量，通過對(duì)催化該反應(yīng)的酶基因ribF的RBS強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)。獲得工

4、程菌RF05S-M40的核黃素激酶活性是出發(fā)菌株的64.8%，核黃素的產(chǎn)量達(dá)到1019.6±25.3mg/L。考察RF05S-M40在不同的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基，RF05S-M40能夠積累2702.8±89.9 mg/L得率137.5 mg/g glucose，是迄今為止報(bào)道的核黃素得率最高工程菌株。
　　本文第二部分利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，將β-胡蘿卜素合成基因整合

5、到基因組上，對(duì)MEP途徑進(jìn)行組合調(diào)控以增強(qiáng)IPP和DMAPP的合成，獲得工程菌ZF43能夠積累21.45±0.46mg/Lβ-胡蘿卜素。G3P和Pyr是MEP途徑的直接前體物，NADPH是β-胡蘿卜素合成的重要輔因子。為了提高這些代謝物的供給，對(duì)中心碳代謝、MEP途徑及β-胡蘿卜素合成途徑進(jìn)行組合優(yōu)化，獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌ZF237T，高密度發(fā)酵能夠獲得2.02g/Lβ-胡蘿卜素。首次在大腸桿菌中將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功