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文檔簡介
1、本文圍繞大腸桿菌(Escherichia coli)核黃素生物合成的中下游途徑,以E.coli K-12 MG1655為出發(fā)菌株進行代謝工程改造。通過改造核黃素生物合成基因和嘌呤生物合成途徑中的關鍵基因,逐步提高核黃素的生物合成。
本研究首先對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和E.coli中的核黃素生物合成途徑的相關基因進行過表達。同時構建了過表達B. subtilis和E.coli核黃素操縱子的質粒p20C
2、-Bsrib和p20C-EC10,分別轉化到野生型E. coli中,構建了菌株RF01B和RF01S。經(jīng)搖瓶發(fā)酵,菌株RF01B生產(chǎn)了200.5 mg/L核黃素,菌株RF01S生產(chǎn)了225.1 mg/L核黃素。結果表明,過表達大腸桿菌自身的核黃素生物合成基因對核黃素的積累更有效。因此,選取 RF01S菌株進行下一步地基因工程改造。
在過量表達核黃素生物合成基因以后,核黃素生物合成的直接前體物--3,4-二羥基-2-丁酮4-磷酸
3、(DHBP)和GTP的有效利用可能是核黃素生物合成的限制因素。因此,以RF01S作為出發(fā)菌株,通過提高ribB基因的表達和改造嘌呤生物合成途徑來增加前體物的供給,進而提高核黃素的產(chǎn)量。首先,通過替換強啟動子的方式過表達ribB基因來增加5-磷酸核酮糖到DHBP的通量。其次,依然通過替換強啟動子的方式對ndk和gmk基因進行過表達來提高GTP的供給。然后,在purA基因中引入突變點來減少分支途徑IMP到AMP的通量。最后,過表達突變的pu
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