微流控生物催化技術(shù)酶促合成天然產(chǎn)物的增效機(jī)理研究.pdf

1、微反應(yīng)器由于具有傳質(zhì)傳熱快、反應(yīng)得率高、操作安全、易于放大等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)高效快速地酶促反應(yīng)，在生物催化領(lǐng)域開(kāi)始嶄露頭角。然而，利用微反應(yīng)器進(jìn)行微流控生物催化技術(shù)合成天然藥物的研究一直未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以酶促合成異槲皮苷和咖啡酸苯乙酯這兩種珍稀的天然藥物為研究對(duì)象，研究在微反應(yīng)器中連續(xù)流和分段流模式的微型生物催化技術(shù)及其過(guò)程機(jī)制，對(duì)于高效制備高附加值天然藥物具有重要意義。主要研究結(jié)果如下：
　　構(gòu)建了連續(xù)流微通道式反應(yīng)器內(nèi)橙皮苷酶

2、選擇性催化水解蘆丁合成異槲皮苷的新方法。研究微通道長(zhǎng)度、酶濃度、底物濃度及溫度等因素對(duì)酶促反應(yīng)的影響。當(dāng)蘆丁濃度1 g/L、酶濃度0.1 g/mL、溫度40℃、流速2μL/min時(shí)，異槲皮苷最大得率為98.6％，最大產(chǎn)率為3.23μM/min，酶的表觀活化能Ea為4.61 kJ/mol。與間歇式反應(yīng)器相比，反應(yīng)時(shí)間由10 h驟減至40min，速率提高了16.1倍。
　　基于新穎的“緩沖液-離子液體/溶劑”反應(yīng)-分離耦合新體系，構(gòu)建

3、了分段流多通道式微反應(yīng)器內(nèi)橙皮苷酶選擇性催化水解蘆丁合成異槲皮苷的新方法。采用單因素法獲得酶促合成異槲皮苷的最優(yōu)工藝條件：當(dāng)流速4μL/min、底物濃度2 g/L、酶濃度1 g/L、溫度30℃時(shí)，異槲皮苷的得率高達(dá)100%。與間歇式反應(yīng)器相比，反應(yīng)時(shí)間由1 h縮短至20 min，速率提高了3倍。這是由于互不相溶的“緩沖液-[Bmim][BF4]/三乙酸甘油酯”兩相在微管道內(nèi)形成塞流，引起傳質(zhì)加劇。與單通道微反應(yīng)器相比，應(yīng)用多通道微反應(yīng)器

4、的單位時(shí)間產(chǎn)量由0.076 g/min提高到0.439 g/min，提高了5.7倍。
　　基于轉(zhuǎn)酯化策略，構(gòu)建了連續(xù)流微槽式反應(yīng)器內(nèi)脂肪酶催化咖啡酸烷基酯與苯乙醇合成咖啡酸苯乙酯的新方法。在常規(guī)間歇式反應(yīng)器中，篩選出最佳底物和催化劑分別為咖啡酸甲酯和Novozym435；將其應(yīng)用于微槽式反應(yīng)器中，探索了酶促合成咖啡酸苯乙酯的工藝條件，進(jìn)而采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化獲得最適條件：當(dāng)酯醇摩爾比1:20、溫度60℃、流速2μL/min、保留時(shí)間

5、2.5 h、咖啡酸甲酯濃度3 mg/mL時(shí)，咖啡酸苯乙酯的得率高達(dá)93.21%。與傳統(tǒng)的間歇式反應(yīng)器（24 h，66.4%）相比，反應(yīng)時(shí)間縮短至原先的1/10，得率提高了26.8%。
　　利用密度泛函理論（DFT）和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)酶促合成咖啡酸苯乙酯的過(guò)程機(jī)制進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，咖啡酸甲酯相對(duì)于其他咖啡酸烷基酯而言，具有更長(zhǎng)的鍵長(zhǎng)和能量而成為最適的轉(zhuǎn)酯化合成底物；在連續(xù)流微槽式反應(yīng)器內(nèi)酶促轉(zhuǎn)酯化合成咖啡酸苯乙酯的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)