廣西產(chǎn)藥用植物絞股藍(lán)遺傳多樣性分析及分子水平鑒定方法的建立.pdf

1、絞股藍(lán)(Gynostemma Pentaphyllum(Thunb)Makino)為葫蘆科(Cucurbitaceae)絞股藍(lán)屬(Gynostemma BL.)多年生草本植物，是廣西特產(chǎn)藥用植物之一。目前已經(jīng)從絞股藍(lán)中分離并鑒定了100多種皂苷類物質(zhì)，其中有八種皂苷與原人參二醇型人參皂苷結(jié)構(gòu)完全相同，是目前除五加科植物以外，少數(shù)證實含有人參皂苷的植物，具有重要的藥用價值和商業(yè)價值。但由于絞股藍(lán)遺傳背景復(fù)雜，又易于與烏蘞莓(Cyratia

2、 japonica)混淆，其開發(fā)利用受到限制。
　　 本研究主要目的是篩選合適的RAPD隨機(jī)引物對廣西不同產(chǎn)地絞股藍(lán)進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建DNA指紋圖譜，為篩選品質(zhì)優(yōu)良的品種及種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)；另一方面利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別絞股藍(lán)及其混淆品烏蘞莓，建立藥用植物絞股藍(lán)分子水平鑒定的方法體系。
　　 本研究采用改進(jìn)的CTAB法成功提取了絞股藍(lán)和烏蘞莓新鮮樣品、干燥樣品DNA。利用生物信息學(xué)方法挑選出20條RAPD隨機(jī)

3、引物，其中19條均能有效擴(kuò)增絞股藍(lán)基因組DNA，且獲得的RAPD指紋圖譜清晰、重復(fù)性好。19條引物共擴(kuò)增出354條帶，分子量在約200～5000bp之間，其中294(83.3％)條為多態(tài)性帶。利用NTSYS-pc軟件計算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity，GS)，按UPGMA法進(jìn)行聚類分析。8份廣西產(chǎn)絞股藍(lán)種質(zhì)材料間的GS值變化范圍為0.5367～0.7825，平均GS值為0.6353。根據(jù)聚類樹狀圖，明顯分為兩大類群，

4、獲得的聚類結(jié)果與絞股藍(lán)地理起源和生長環(huán)境一致。
　　 通過對絞股藍(lán)指紋圖譜分析，獲得兩個絞股藍(lán)RAPD標(biāo)記(Length1≈500bp，Length2≈750bp)，分別命名為J-500和J-750，可用作在分子水平上鑒別絞股藍(lán)。將J-750克隆測序分析，8個克隆序列相似性均在97％以上，并發(fā)現(xiàn)是一段未報道過的新DNA序列。利用Oligo6軟件針對該序列設(shè)計特異引物，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記；利用SCAR標(biāo)記結(jié)合18S