絲瓜絡(luò)載體固定木瓜蛋白酶.pdf

1、固定化酶與游離酶相比,具有下列優(yōu)點(diǎn):固定化酶容易與底物、產(chǎn)物分開;能夠較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行裝柱連續(xù)反應(yīng)和反復(fù)分批反應(yīng);通常情況下,可以提高酶的穩(wěn)定性;能夠嚴(yán)格控制酶的反應(yīng)過程;酶沒有在產(chǎn)物溶液中殘留,提純工藝得到簡(jiǎn)化;比起游離酶更加適合多酶反應(yīng);產(chǎn)物的收率得到極大的提高;酶使用效率的提高使生產(chǎn)成本降低。酶的固定化方法通常可以分為三大類,即非化學(xué)結(jié)合法,化學(xué)結(jié)合法和包埋法。而非化學(xué)結(jié)合法包括結(jié)晶法,分散法,物理吸附法和離子結(jié)合法等;化學(xué)結(jié)合法則

2、包括共價(jià)結(jié)合法,交聯(lián)法;包埋法可分為網(wǎng)絡(luò)型和微囊型兩種類型。其中利用共價(jià)結(jié)合法制備的固定化酶有以下優(yōu)勢(shì):酶與載體的緊密結(jié)合,使酶不易從載體上流失或分離;酶在載體表面局部結(jié)合讓固定化酶可以與底物充分接觸;因?yàn)槊负洼d體材料之間強(qiáng)有力的相互作用,所以酶的穩(wěn)定性增加。
　　纖維素是自然界中存在數(shù)量最多的大分子化合物之一,是由β-1,4連接的 D-葡萄糖基組成的直鏈分子,具有來源豐富、價(jià)格低廉、易改性、生化性質(zhì)穩(wěn)定、有一定的強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)

3、用于固定化酶載體。而其織物狀形態(tài)不僅能為酶的固定化提供足夠的比表面積,與傳統(tǒng)的顆?；蚍垠w載體相比,其固定化酶更易于與產(chǎn)物分離。絲瓜絡(luò)是葫蘆科植物的成熟果實(shí)的硬質(zhì)纖維管束網(wǎng)絡(luò),主要由纖維素、半纖維素及木素組成。絲瓜絡(luò)已被用于各種生物細(xì)胞的固定,但將其用于酶的固定化,到目前為止還很少這樣的報(bào)道。
　　木瓜蛋白酶又稱木瓜酶,是有由212個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量為23406的含巰基肽鏈的內(nèi)切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有較廣

4、泛的特異性,對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力,同時(shí),還具有合成功能,能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)。因此木瓜蛋白酶作為一種重要的生化試劑,在各個(gè)行業(yè)上有廣泛的應(yīng)用。
　　在本文中,通過氧化劑高碘酸鈉把堿活化后的絲瓜絡(luò)纖維素分子上 C2和 C3位置的羥基碳氧化成醛基,生成含有醛基的雙醛基氧化纖維素。食品工業(yè)中重要的生物催化劑木瓜蛋白酶,與絲瓜絡(luò)上氧化后形成的醛基發(fā)生西夫堿反應(yīng),可獲得絲瓜絡(luò)固定化木瓜蛋白酶。堿溶法測(cè)定絲瓜

5、絡(luò)上醛基的生成量和傅里葉變換紅外光譜的分析可以驗(yàn)證高碘酸鈉氧化絲瓜絡(luò)的結(jié)果;用正交試驗(yàn)選出氧化和固定的最優(yōu)條件及研究了固定化木瓜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性,并與游離酶進(jìn)行了比較。通過正交試驗(yàn)選出使醛基含量較高時(shí)的最優(yōu)反應(yīng)條件:絲瓜絡(luò)0.5 g,反應(yīng)時(shí)間4.5 h,反應(yīng)溫度40℃,高碘酸鈉濃度4.5％。而固定化后酶活較高時(shí)的最優(yōu)反應(yīng)條件:反應(yīng)時(shí)間6 h,給酶濃度1.0 mg/mL,氧化絲瓜絡(luò)給量0.2 g,酶的給量7 mL。而在最優(yōu)的氧化與

6、固定化條件下,固定化木瓜蛋白酶的最大活力為42.6 U/g載體;固定化木瓜蛋白酶在50℃,pH7.5的條件下表現(xiàn)為最大的活力,而游離木瓜蛋白酶則在40℃,pH7.0的條件下表現(xiàn)為最大的活力;固定化木瓜蛋白酶的米氏常數(shù)為7.90×10-3 mol/L,而游離酶則為7.74×10-3 mol/L;在4℃條件下放置21 d后,固定化酶的剩余活力仍保持在70%;操作八批次后,酶活保留60.6%。跟游離酶相比,固定化木瓜蛋白酶表現(xiàn)出的 pH穩(wěn)定性

7、、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性都有了較大的改善。在最優(yōu)的固定化條件下制得的固定化木瓜蛋白酶改良啤酒的品質(zhì),分別研究了黃啤和黑啤的蛋白質(zhì)降解效果。固定化木瓜蛋白酶處理黃啤和黑啤之后,黃啤混濁度降低了0.13個(gè)單位,蛋白質(zhì)含量下降21.3%;黑啤混濁度降低了0.05個(gè)單位,蛋白質(zhì)含量下降了9.9%。這與其它類似應(yīng)用的對(duì)比表明,啤酒的混濁度下降比較明顯。
　　本實(shí)驗(yàn)的研究說明了氧化絲瓜絡(luò)材料是木瓜蛋白酶固定化的良好載體,研究其對(duì)黃