強化混合超臨界流體輔助霧化技術(shù)制備藥用蛋白及復(fù)合微粒應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)及多肽類藥物是藥物領(lǐng)域研究的熱點之一，因為這類生物大分子具有很高的藥效專一性，并且在很多疾病治療中無可替代。通過將蛋白質(zhì)微粒化，可以避免注射給藥，使其通過非侵入式給藥途徑吸收。蛋白與其它組分的復(fù)合微?；?，則可能帶來緩釋效果，并能促進(jìn)藥物吸收等。為了使蛋白質(zhì)微粒系統(tǒng)在特定的給藥途徑中有效地傳輸，并起到預(yù)期的作用，微粒的組成、形貌、粒徑及其分布需要嚴(yán)格的控制。因此微粒制備過程的開發(fā)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究非常重要。同時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物活性極易

2、受到破壞，因而對于微?；^程的要求更高。
　　強化混合的超臨界流體輔助霧化技術(shù)(SAA-HCM)利用超臨界流體對溶液的輔助霧化作用制備超細(xì)微粒，并采用水力空化現(xiàn)象強化超臨界二氧化碳(SCCO2)與溶液的混合，其對微粒的形貌和粒徑控制能力強，過程條件較為溫和，是一項應(yīng)用前景極為廣闊的綠色微粒化技術(shù)。SAA-HCM不但可以處理有機(jī)溶劑體系，尤其可以從水溶液中制備水溶性物質(zhì)，因此此過程有望用于蛋白質(zhì)及多肽類藥物微粒化。目前，SAA-HC

3、M過程的研究仍處在發(fā)展階段，已有的應(yīng)用對象多為小分子藥物以及聚合物，在蛋白質(zhì)微?；膽?yīng)用方面鮮有報道，關(guān)于功能性輔料和藥用蛋白質(zhì)的復(fù)合微粒系統(tǒng)研究則仍為空白。
　　本研究將SAA-HCM技術(shù)的應(yīng)用拓展到蛋白類藥物的微?；^程。論文按照“模型蛋白基礎(chǔ)研究→藥用蛋白基礎(chǔ)研究→聚合物/藥用蛋白復(fù)合體系基礎(chǔ)研究→聚合物/藥用蛋白復(fù)合體系應(yīng)用基礎(chǔ)研究”的基本思路展開。對SAA-HCM過程制備蛋白質(zhì)藥物微粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)問題進(jìn)行深入研究，得出了蛋

4、白質(zhì)微粒化和聚合物/蛋白質(zhì)微?；^程中微粒形成的一般規(guī)律，為蛋白質(zhì)微?；^程提供指導(dǎo);對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)行系統(tǒng)的表征和分析，獲得了蛋白質(zhì)分子在微?；氨４孢^程中結(jié)構(gòu)和活性變化的大量信息，為蛋白質(zhì)微粒化過程中的結(jié)構(gòu)和活性優(yōu)化提供依據(jù);制備得到具有獨特性質(zhì)的蛋白質(zhì)/聚合物復(fù)合微粒體系，并表征了藥物體內(nèi)作用特點，為其進(jìn)一步應(yīng)用指明了方向。
　　首先，選取溶菌酶為模型蛋白，探究了SAA-HCM過程制備蛋白質(zhì)超細(xì)微粒的可行性和規(guī)律。可以

5、得到形貌均一，界面清晰且分散的溶菌酶超細(xì)微粒。微粒的粒徑既可以達(dá)到適合肺部吸入式給藥的1-5μm，亦可以分布在亞微米級，可用于注射使用。研究過程參數(shù)對于微粒形貌和粒徑的影響，結(jié)果表明沉淀器溫度和溶劑組成對形貌至關(guān)重要，而混合器溫度對微粒形貌同樣有明顯的影響。壓力及溶液濃度則對粒徑影響顯著，CO2與水溶液的氣液質(zhì)量流量比對粒徑的影響較使用有機(jī)溶液體系時弱。SAA-HCM具有很寬的操作窗口，除了在一些較為極端的溫度和壓力操作條件下，制得的溶

6、菌酶微粒與原料相比活性均保持在85％以上。經(jīng)過SAA-HCM處理后溶菌酶化學(xué)結(jié)構(gòu)保持良好，沒有出現(xiàn)降解或聚集;溶液中高級結(jié)構(gòu)保持完整，而固態(tài)下折疊結(jié)構(gòu)少量增加;熱穩(wěn)定性維持不變，變性溫度保持在204.8℃，而水含量略有升高，至5.54％;微粒為無定形狀態(tài)。對比了SAA-HCM和噴霧干燥、傳統(tǒng)鹽析結(jié)晶手段制備的溶菌酶產(chǎn)品的各項性質(zhì)，證實了SAA-HCM中SCCO2對于粒徑控制的重要作用，與噴霧干燥的產(chǎn)品相比，微粒粒徑大大降低，分布更窄更均

7、勻，結(jié)構(gòu)和活性保持更佳，且能長期保存。
　　在溶菌酶微?；芯康幕A(chǔ)上，研究了利用SAA-HCM從水溶液中制備藥用蛋白胰島素超細(xì)微粒的過程。溶解條件、沉淀器溫度以及溶液濃度的改變會得到褶皺、高度折疊、部分塌陷以及光滑的多種微粒表面形貌。溶液濃度對于胰島素微粒粒徑有明顯影響，可以制備得到分布于0.5-5μm胰島素超細(xì)微粒，且胰島素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)均可以完好保持，水含量在7％左右與原料相當(dāng)。通過大鼠體內(nèi)試驗，發(fā)現(xiàn)處理后胰島素完

8、整保持了其體內(nèi)生物活性。提出了胰島素溶液液滴干燥到微粒形成的蛋白成殼機(jī)理，較好地闡釋胰島素微粒制備中多種形貌形成的過程，并可用于其他蛋白質(zhì)微?；^程的解釋和指導(dǎo)中。
　　在胰島素微?；芯康幕A(chǔ)上，利用SAA-HCM過程從水溶液中制備了胰島素/殼聚糖復(fù)合超細(xì)微粒。復(fù)合微粒表面具有連續(xù)的波紋型褶皺，且隨著蛋白質(zhì)含量增大而愈加明顯。殼聚糖和胰島素投料比以及溶液濃度對粒徑影響明顯，粒徑在0.3-5μm間可控。蛋白結(jié)構(gòu)和熱行為的表征和分析

9、說明胰島素與殼聚糖分子在復(fù)合微粒中存在相互作用，顯著降低了胰島素的螺旋結(jié)構(gòu)成分，而重新溶解于水溶液后，胰島素高級結(jié)構(gòu)基本恢復(fù);而胰島素的分散形式為固體溶液分子級分散，且殼聚糖的作用可防止胰島素在長期存放過程中的降解。著重考察了胰島素分子在復(fù)合微球中的空間分布，發(fā)現(xiàn)胰島素具有表面富集的行為，驗證了蛋白成殼機(jī)理的正確性。復(fù)合微球的載藥效率可達(dá)93.4％，胰島素在浸沒于溶液條件下釋放較快，最快可在4h內(nèi)釋放完全，且存在突釋與吸附行為的結(jié)合，而

10、在模擬肺部黏膜條件下釋放較慢，8h僅釋放30％。最后，將胰島素的空間分布與復(fù)合微球形貌和胰島素釋放行為相關(guān)聯(lián)，可對微球形貌控制和蛋白釋放起到指導(dǎo)作用。
　　在胰島素復(fù)合微球成功制備的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行應(yīng)用導(dǎo)向的研究。基于SAA-HCM過程可制備具有高吸濕性的殼寡糖的超細(xì)微粒，水含量最低可以控制在6％以下。利用此過程從水溶液中制備了胰島素/殼寡糖復(fù)合超細(xì)微粒。研究了胰島素經(jīng)過復(fù)合后結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及在復(fù)合微粒中的分布情況。復(fù)合微粒載藥

11、效率可達(dá)87.3％。制備了具有較高可吸入比例(52.3％)的復(fù)合微球，并以此復(fù)合微球進(jìn)行胰島素大鼠體內(nèi)藥物吸收試驗，結(jié)果表明，肺部給藥后，殼寡糖復(fù)合微球促進(jìn)了胰島素分子經(jīng)過肺部黏膜的吸收，藥效生物利用度達(dá)到48.9％，展示了這種復(fù)合微球體系在胰島素肺部吸入式給藥途徑中的優(yōu)勢。
　　SAA-HCM過程能夠成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)類藥物微粒的制備中，過程避免了有機(jī)溶劑的使用，操作條件對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的保持比較有利，制備得到的微粒形貌和粒