微生物催化肉桂醛、肉桂醇和潛手性芳香酮的反應(yīng)研究.pdf

1、肉桂是廣西重要的林業(yè)資源,其主產(chǎn)區(qū)為廣西十萬(wàn)大山南麓和西江流域。廣西肉桂產(chǎn)量占全國(guó)60％以上,桂油產(chǎn)量占全國(guó)90%。肉桂廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域,其揮發(fā)油(肉桂油)是重要的天然香料之一。本論文以肉桂皮提取揮發(fā)油后所余殘?jiān)慈夤鹪⑷夤鹩偷闹饕煞秩夤鹑?肉桂醛的衍生物肉桂醇及潛手性芳香酮為起始底物,開(kāi)展了一系列的微生物催化反應(yīng)研究。主要研究?jī)?nèi)容和取得的成果如下:
　　1.肉桂渣生物降解制備肉桂酰胺及其工藝研究。肉桂皮提取肉桂油后

2、的固體物渣通常作為肥料或廢棄物排放,沒(méi)有得到有效利用。為此,本文開(kāi)展了微生物降解肉桂渣的研究為綜合利用肉桂皮資源提供參考。
　　從土壤中篩選獲得了1株能將肉桂渣中部分成分轉(zhuǎn)化為肉桂酰胺的菌株CG19,它能使肉桂渣降解制備肉桂酰胺。首先進(jìn)行了菌株CG19的鑒定,該菌株經(jīng)過(guò)ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,被鑒定為鏈霉菌(Streptomyces sp.),命名為Streptomyces sp.CG19。然后進(jìn)行了CG19培養(yǎng)條件優(yōu)

3、化,優(yōu)化結(jié)果是:CG19在以30 g·L-1麥芽糖為碳源,10 g·L-1硫酸銨為氮源,pH為5.0,30℃的條件下培養(yǎng)72 h,所得濕菌體質(zhì)量最大。最后進(jìn)行了肉桂渣降解條件的優(yōu)化,工藝優(yōu)化條件是:肉桂渣8.0 g·L-1,濕菌體40 g·L-1,無(wú)水乙醇30 mL·L-1,100 mL pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液,30℃下反應(yīng)3 d。肉桂酰胺的收率為0.32%。
　　2.肉桂醇生物轉(zhuǎn)化制備3-苯丙醇的菌株篩選及其工藝優(yōu)化。從特

4、殊土壤中篩選到一株可催化肉桂醇生成3-苯丙醇的微生物菌株CG10,經(jīng)過(guò)16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定,將菌株CG10鑒定為毛霉菌(Mucor sp.),并把該菌株命名為Mucor sp.CG10。肉桂醇生物轉(zhuǎn)化制備3-苯丙醇的優(yōu)化條件是:在糊精質(zhì)量濃度為30 g·L-1,蛋白胨質(zhì)量濃度為16 g·L-1,100 mL pH為5.0的發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃下培養(yǎng)72 h,分三次加入底物肉桂醇。肉桂醇的初始加入量為2 mL·L-1反應(yīng)2

5、4 h,二次加入量為0.5 mL·L-1反應(yīng)8 h,三次加入量為0.5 mL·L-1反應(yīng)16 h,Mucor sp.CG10催化肉桂醇的轉(zhuǎn)化率為99%,反應(yīng)生成3-苯丙醇的選擇性為92%,轉(zhuǎn)化液中3-苯丙醇的最高產(chǎn)量可達(dá)2.9 g·L-1。較優(yōu)化前的產(chǎn)量1.3 g·L-1提高了123%。
　　3.微生物催化肉桂醛的還原反應(yīng)及其工藝優(yōu)化。證明了微生物還原肉桂醛時(shí)優(yōu)先生成肉桂醇,之后再進(jìn)一步還原生成3-苯丙醇。(1)采用富集培養(yǎng)方式對(duì)

6、土壤中的菌株進(jìn)行了大量耐受肉桂醛的篩選篩選,得到7株能將肉桂醛選擇性加氫生成肉桂醇的菌株(肉桂醛轉(zhuǎn)化率>20%),其中菌株CG08的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定結(jié)果表明,菌株CG08為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。并把該菌株命名為Citrobacter freundii CG08。CG08催化肉桂醛還原制備肉桂醇的優(yōu)化條件是:在葡萄糖為碳源,蛋白胨為氮源,100 mL pH為6.0的

7、發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃下培養(yǎng)72 h,分兩次加入底物肉桂醛。肉桂醛的初始加入量為2.0 mL·L-1、反應(yīng)40 h,二次加入量為1.0 mL·L-1,反應(yīng)32 h,肉桂醛的轉(zhuǎn)化率為100%,反應(yīng)生成肉桂醇的選擇性為90%,轉(zhuǎn)化液中肉桂醇的最高產(chǎn)量可達(dá)2.9 g·L-1。CG08能高效、高選擇性的將肉桂醛還原為肉桂醇,但是不能將肉桂醇繼續(xù)還原為3-苯丙醇。(2)進(jìn)行了菌株Mucor sp. CG10還原肉桂醛的研究。優(yōu)化條件是:在糊精質(zhì)量濃度

8、為20 g·L-1,蛋白胨質(zhì)量濃度為20 g·L-1,pH為5.0的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,加入2 mL·L-1肉桂醛,反應(yīng)27 h。肉桂醛轉(zhuǎn)化率為92%,生成肉桂醇的選擇性為88%。若再向轉(zhuǎn)化液中添加24 g·L-1 Mucor sp. CG10濕菌體,此時(shí)的產(chǎn)物肉桂醇將繼續(xù)被還原為3-苯丙醇。反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中3-苯丙醇的濃度達(dá)到1.9 g·L-1,整個(gè)反應(yīng),肉桂醛的轉(zhuǎn)化率為100%,3-苯丙醇的選擇性為86%,只余少

9、量的肉桂醇未被還原。結(jié)果表明,通過(guò)兩步反應(yīng),Mucor sp. CG10能高效的將肉桂醛還原為3-苯丙醇。
　　4. Mucor sp. CG10不對(duì)稱還原潛手性芳香酮合成相應(yīng)手性(S)-芳香醇研究。并探討了取代基的性質(zhì)對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率、e.e.值及微生物對(duì)反應(yīng)底物的耐受性的影響。合成方法是:Mucor sp. CG10在以糊精為碳源,蛋白胨為氮源,培養(yǎng)pH為5.0,培養(yǎng)溫度為30℃的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h得到發(fā)酵液,將

10、發(fā)酵液抽濾得到濕菌體。將24 g·L-1濕菌體放入100 mL pH為4.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入20 g·L-1葡萄糖作為輔助底物,再分別加入20 mM苯乙酮及其9種芳環(huán)取代物,在30℃,180 r·min-1,反應(yīng)3 d,分別生成對(duì)應(yīng)的(S)-型手性芳香醇。反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率在52~99%范圍內(nèi),e.e.值在38~99%范圍內(nèi)。芳香酮苯環(huán)上的取代基對(duì)轉(zhuǎn)化率、e.e.值及微生物對(duì)反應(yīng)底物的耐受性均有顯著影響。對(duì)于對(duì)位鹵代苯乙酮而言,隨著取