麥胚蛋白酶解物的制備及其抗氧化功能研究.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物之一，年產(chǎn)量在1億t以上。作為小麥加工的副產(chǎn)物，目前我國麥胚年蘊(yùn)藏量達(dá)200萬t。麥胚是小麥籽粒的生命源泉，其中含有約30％的蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源。麥胚蛋白通過特異的蛋白酶水解可生成具有抗氧化活性的氨基酸序列，即抗氧化肽。已有研究表明，人類許多慢性疾病及衰老現(xiàn)象均和體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān)，過量的自由基對機(jī)體產(chǎn)生氧化性損傷，當(dāng)損傷不能及時(shí)修復(fù)并且累積到一定程度就會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。而來源于食品的天然抗

2、氧化劑則有助于消除過量的自由基，維持人體內(nèi)的自由基平衡。因此，利用麥胚蛋白制備對抗自由基、延緩衰老的功能性食品或食品配料，既可為麥胚等富含蛋白質(zhì)的農(nóng)副產(chǎn)品資源的深度開發(fā)和利用提供理論依據(jù)，也為實(shí)現(xiàn)小麥資源的綜合利用、提高其附加值開辟新的途徑。 本論文以脫脂麥胚為原料，對麥胚蛋白在稀堿和微細(xì)化處理?xiàng)l件下的提取工藝進(jìn)行研究，并對麥胚蛋白的酶解工藝、抗氧化活性及作用機(jī)理進(jìn)行研究，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1．首先采用錘式粉碎與

3、膠體粉碎相結(jié)合的方法對脫脂麥胚進(jìn)行微細(xì)化處理，然后利用堿提、超濾濃縮法提取制備麥胚蛋白，并通過Box—Behnken中心組合設(shè)計(jì)(CCD)及響應(yīng)面分析(RSM)建立預(yù)測麥胚蛋白提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝，在麥胚粒度為23μm、pH值9.5、提取溫度51℃的條件下，經(jīng)微細(xì)化處理的蛋白提取率為68.6％，比未經(jīng)微細(xì)化處理的(過80目篩)提高30.63％。 2．采用SDS—PAGE法測定麥胚蛋白的分子量為11.6k

4、Da～93.8kDa。功能特性研究結(jié)果表明，麥胚蛋白在pH4～5范圍內(nèi)溶解度最低，與大豆分離蛋白相比，其吸油性、乳化活性、發(fā)泡性較強(qiáng)，吸水性、乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性相對較弱。 3．以DH及酶解產(chǎn)物對DPPH·清除率為考察指標(biāo)，從5種商品蛋白酶中確定了麥胚蛋白的最適水解酶為堿性蛋白酶Alcalase。預(yù)處理工藝研究結(jié)果表明，對麥胚蛋白進(jìn)行高速剪切乳化5 min，可將其水解度(DH)和肽得率(TCA—PSI)分別提高29.85％和1

5、2.53％。通過單因素試驗(yàn)確定了高速剪切乳化預(yù)處理(22000r/min，5min)條件下Alcalase水解麥胚蛋白的最適參數(shù)為：酶用量[E]/[S]為4000U/g、底物濃度為4％、pH為8.5、溫度55℃、時(shí)間240min。在此條件下，體系水解度為18.61±0.23％，肽得率為71.02±0.45％，平均鏈長為5.37個(gè)氨基酸，平均分子量為555.3 Da。 4．為研究不同分子量分布的肽段的抗氧化活性，選用截留分子量為5

6、 kDa、3 kDa、1 kDa的改良纖維素平板膜對麥胚蛋白酶解物進(jìn)行超濾分級，選擇麥胚肽一級超濾的最佳操作參數(shù)為：壓力為0.10MPa、料液濃度為2.0％～2.5％、溫度為35℃。采用陰陽離子交換樹脂脫鹽法對超濾分級肽進(jìn)行純化，以肽回收率和脫鹽率為考察指標(biāo)，確定10 CV/h為最佳流速。經(jīng)過分級和脫鹽處理的4種精制麥胚肽除分子量最大的肽Ⅰ外，均具有顯著的抗氧化活性。 5．采用5種化學(xué)模型對3種精制麥胚肽的抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)

7、果顯示，肽Ⅳ的還原力最強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.7 mg．mL-1時(shí)，其還原力與1.0 mg．mL-1 GSH相當(dāng)；3種麥胚肽對DPPH·的清除均呈量效關(guān)系，其IC50分別為肽Ⅳ為0.578mg．mL-1、肽Ⅲ為0.769 mg．mL-1、肽Ⅱ?yàn)?.661 mg．mL-1，其參考對照GSH為0.28 mg．mL-1。在鄰苯三酚體系中，肽Ⅳ對O2—·的清除能力最強(qiáng)，與同劑量的GSH無顯著性差異(p＞0.05)。相同濃度下，肽Ⅲ清除·OH的能力和對F

8、e2+的螯合能力顯著強(qiáng)于肽Ⅳ，表明肽Ⅲ與肽Ⅳ的抗氧化機(jī)制有所不同。熒光分光光度法測定肽Ⅳ和Ⅲ在全脂奶粉體系中均具有較好的抗氧化活性，當(dāng)添加量達(dá)到脂質(zhì)含量的5％時(shí)，抗氧化效果皆優(yōu)于1％的BHT，而稍次于1％的GSH。 6．采用離體小鼠肝臟線粒體，以Ca2+和Fe2+—Vc為誘導(dǎo)劑，建立了亞細(xì)胞水平的高效氧化損傷模型。經(jīng)麥胚肽保護(hù)后，可顯著抑制線粒體ATPase活性下降和MDA的生成，并有效促使膜蛋白羰基含量下降，對線粒體腫脹和膜電

9、位的降低也都有明顯的抑制作用。通過透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)麥胚肽對緩解線粒體氧化應(yīng)激損傷、保持線粒體的完整結(jié)構(gòu)具有顯著作用。 7．采用強(qiáng)陰離子型交換色譜、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜對麥胚肽Ⅳ進(jìn)行分離純化，得到了兩種均為單一性組分的高抗氧化活性肽SEC—5和RP-2。采用ESI—MS對2種麥胚肽進(jìn)行分子量測定及結(jié)構(gòu)表征，SEC—5的分子量為296.2Da，氨基酸序列為Phe—Met；RP-2的分子量為246.1