麥胚蛋白酶解物的制備及其抗氧化功能研究.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要糧食作物之一，年產(chǎn)量在1億t以上。作為小麥加工的副產(chǎn)物，目前我國(guó)麥胚年蘊(yùn)藏量達(dá)200萬(wàn)t。麥胚是小麥籽粒的生命源泉，其中含有約30％的蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源。麥胚蛋白通過(guò)特異的蛋白酶水解可生成具有抗氧化活性的氨基酸序列，即抗氧化肽。已有研究表明，人類(lèi)許多慢性疾病及衰老現(xiàn)象均和體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān)，過(guò)量的自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化性損傷，當(dāng)損傷不能及時(shí)修復(fù)并且累積到一定程度就會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。而來(lái)源于食品的天然抗

2、氧化劑則有助于消除過(guò)量的自由基，維持人體內(nèi)的自由基平衡。因此，利用麥胚蛋白制備對(duì)抗自由基、延緩衰老的功能性食品或食品配料，既可為麥胚等富含蛋白質(zhì)的農(nóng)副產(chǎn)品資源的深度開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)，也為實(shí)現(xiàn)小麥資源的綜合利用、提高其附加值開(kāi)辟新的途徑。 本論文以脫脂麥胚為原料，對(duì)麥胚蛋白在稀堿和微細(xì)化處理?xiàng)l件下的提取工藝進(jìn)行研究，并對(duì)麥胚蛋白的酶解工藝、抗氧化活性及作用機(jī)理進(jìn)行研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1．首先采用錘式粉碎與

3、膠體粉碎相結(jié)合的方法對(duì)脫脂麥胚進(jìn)行微細(xì)化處理，然后利用堿提、超濾濃縮法提取制備麥胚蛋白，并通過(guò)Box—Behnken中心組合設(shè)計(jì)(CCD)及響應(yīng)面分析(RSM)建立預(yù)測(cè)麥胚蛋白提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝，在麥胚粒度為23μm、pH值9.5、提取溫度51℃的條件下，經(jīng)微細(xì)化處理的蛋白提取率為68.6％，比未經(jīng)微細(xì)化處理的(過(guò)80目篩)提高30.63％。 2．采用SDS—PAGE法測(cè)定麥胚蛋白的分子量為11.6k

4、Da～93.8kDa。功能特性研究結(jié)果表明，麥胚蛋白在pH4～5范圍內(nèi)溶解度最低，與大豆分離蛋白相比，其吸油性、乳化活性、發(fā)泡性較強(qiáng)，吸水性、乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性相對(duì)較弱。 3．以DH及酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率為考察指標(biāo)，從5種商品蛋白酶中確定了麥胚蛋白的最適水解酶為堿性蛋白酶Alcalase。預(yù)處理工藝研究結(jié)果表明，對(duì)麥胚蛋白進(jìn)行高速剪切乳化5 min，可將其水解度(DH)和肽得率(TCA—PSI)分別提高29.85％和1

5、2.53％。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了高速剪切乳化預(yù)處理(22000r/min，5min)條件下Alcalase水解麥胚蛋白的最適參數(shù)為：酶用量[E]/[S]為4000U/g、底物濃度為4％、pH為8.5、溫度55℃、時(shí)間240min。在此條件下，體系水解度為18.61±0.23％，肽得率為71.02±0.45％，平均鏈長(zhǎng)為5.37個(gè)氨基酸，平均分子量為555.3 Da。 4．為研究不同分子量分布的肽段的抗氧化活性，選用截留分子量為5

6、 kDa、3 kDa、1 kDa的改良纖維素平板膜對(duì)麥胚蛋白酶解物進(jìn)行超濾分級(jí)，選擇麥胚肽一級(jí)超濾的最佳操作參數(shù)為：壓力為0.10MPa、料液濃度為2.0％～2.5％、溫度為35℃。采用陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫鹽法對(duì)超濾分級(jí)肽進(jìn)行純化，以肽回收率和脫鹽率為考察指標(biāo)，確定10 CV/h為最佳流速。經(jīng)過(guò)分級(jí)和脫鹽處理的4種精制麥胚肽除分子量最大的肽Ⅰ外，均具有顯著的抗氧化活性。 5．采用5種化學(xué)模型對(duì)3種精制麥胚肽的抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)

7、果顯示，肽Ⅳ的還原力最強(qiáng)，當(dāng)濃度為1.7 mg．mL-1時(shí)，其還原力與1.0 mg．mL-1 GSH相當(dāng)；3種麥胚肽對(duì)DPPH·的清除均呈量效關(guān)系，其IC50分別為肽Ⅳ為0.578mg．mL-1、肽Ⅲ為0.769 mg．mL-1、肽Ⅱ?yàn)?.661 mg．mL-1，其參考對(duì)照GSH為0.28 mg．mL-1。在鄰苯三酚體系中，肽Ⅳ對(duì)O2—·的清除能力最強(qiáng)，與同劑量的GSH無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。相同濃度下，肽Ⅲ清除·OH的能力和對(duì)F

8、e2+的螯合能力顯著強(qiáng)于肽Ⅳ，表明肽Ⅲ與肽Ⅳ的抗氧化機(jī)制有所不同。熒光分光光度法測(cè)定肽Ⅳ和Ⅲ在全脂奶粉體系中均具有較好的抗氧化活性，當(dāng)添加量達(dá)到脂質(zhì)含量的5％時(shí)，抗氧化效果皆?xún)?yōu)于1％的BHT，而稍次于1％的GSH。 6．采用離體小鼠肝臟線粒體，以Ca2+和Fe2+—Vc為誘導(dǎo)劑，建立了亞細(xì)胞水平的高效氧化損傷模型。經(jīng)麥胚肽保護(hù)后，可顯著抑制線粒體ATPase活性下降和MDA的生成，并有效促使膜蛋白羰基含量下降，對(duì)線粒體腫脹和膜電

9、位的降低也都有明顯的抑制作用。通過(guò)透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)麥胚肽對(duì)緩解線粒體氧化應(yīng)激損傷、保持線粒體的完整結(jié)構(gòu)具有顯著作用。 7．采用強(qiáng)陰離子型交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜對(duì)麥胚肽Ⅳ進(jìn)行分離純化，得到了兩種均為單一性組分的高抗氧化活性肽SEC—5和RP-2。采用ESI—MS對(duì)2種麥胚肽進(jìn)行分子量測(cè)定及結(jié)構(gòu)表征，SEC—5的分子量為296.2Da，氨基酸序列為Phe—Met；RP-2的分子量為246.1