基于聚合物固定生物識(shí)別分子和納米增敏新法的安培生物傳感研究.pdf

1、生物傳感分析是將生物活性材料(酶、抗體/抗原、核酸、適體等)的分子識(shí)別功能與物理化學(xué)傳感換能技術(shù)有機(jī)結(jié)合的現(xiàn)代分析化學(xué)分支，具有靈敏度高、選擇性好、操作便利、分析速度快、成本低、易于實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測等特點(diǎn)，在復(fù)雜環(huán)境乃至活體分析中也不乏其應(yīng)用實(shí)例。自第一支生物傳感器在20世紀(jì)60年代誕生以來，生物傳感分析領(lǐng)域發(fā)展迅速，備受學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界關(guān)注。有效固定生物識(shí)別材料是研制生物傳感器的關(guān)鍵步驟之一，采用化學(xué)聚合法或電化學(xué)聚合法制備生物兼容性聚合物

2、生物敏感材料一直是固定生物識(shí)別分子的重要方法。近年來，隨著納米科技的蓬勃發(fā)展，納米生物傳感迅速成為生物傳感分析領(lǐng)域的國際前沿和熱點(diǎn)。本學(xué)位論文中，我們簡要綜述了電化學(xué)生物傳感器的近期進(jìn)展，以及聚合物和納米材料在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用，并針對(duì)基于聚合物固定生物識(shí)別分子和納米增敏新法的生物傳感分析開展了系列研究工作，主要內(nèi)容如下：
　　 ⑴將化學(xué)/電化學(xué)聚合法有機(jī)結(jié)合，提出了在含酶和單體懸濁液/水溶液中一鍋法化學(xué)預(yù)氧化-電聚合單體(CP

3、EM)的新方法用于高效固定酶，藉此研制了高敏安培生物傳感器。考察了1，4-苯二硫酚(BDT)、1，6-已二硫醇(HDT)、鄰苯二胺、鄰氨基酚和吡咯等單體；鐵氰化鉀和對(duì)苯醌兩種預(yù)氧化劑；葡萄糖氧化酶(GOx)和堿性磷酸酶兩種酶及其生物傳感器。代表性實(shí)驗(yàn)步驟如下：在BDT單體和酶的水相懸濁液中加入預(yù)氧化劑K3Fe(CN)6引發(fā)化學(xué)氧化聚合，得到包埋有大量高活性酶分子的BDT寡聚體-酶復(fù)合物，再電氧化聚合該復(fù)合物和BDT單體，最終制得高性能酶

4、膜。與常規(guī)電聚合法(CEP)相比，CPEM法所制葡萄糖安培生物傳感器的靈敏度提高至32.4倍。通過電化學(xué)石英晶體微天平(EQCM)和紫外-可見光譜法的定量測試，發(fā)現(xiàn)采用CPEM法可顯著提高酶膜中酶的負(fù)載量和比活性。
　　 ⑵以酶生H2O2(EG-H2O2)為預(yù)氧化劑，提出了高效固定酶的一鍋法生化預(yù)氧化-電聚合單體(BPEM)新方法，藉此研制了高敏葡萄糖安培生物傳感器?；緦?shí)驗(yàn)步驟如下：在含GOx和2,5-二巰基-1，3，4-噻二

5、唑(DMcT)的水相懸濁液中加入葡萄糖，酶生H2O2使DMcT氧化聚合，生成DMcT寡聚體-GOx復(fù)合物，再電氧化聚合該復(fù)合物和DMcT單體，可在電極表面制得高性能酶膜。與CEP法比，該法所制傳感器的靈敏度提高至119倍，檢測下限降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。發(fā)現(xiàn)BPEM法所制酶電極的靈敏度比基于外加H2O2的CPEM法更高，原因可能為生化預(yù)氧化聚合/包埋作用主要發(fā)生在酶分子附近(反應(yīng)臨近性)，故酶負(fù)載量更大。采用EQCM監(jiān)測了電極修飾過程，發(fā)現(xiàn)D

6、McT聚合膜可被電還原而從電極上脫落，這有利于電極基底的電化學(xué)再生。
　　 ⑶采用多巴胺(DA)為單體、HAuCl4或H2PtCl6為預(yù)氧化劑，通過CPEM法固定GOx和半乳糖氧化酶，制備了新型聚合物生物納米復(fù)合物(PBNCs)：聚多巴胺(PDA)-酶-納米金(或鉑)(AuNPs或PtNPs)復(fù)合物，籍此研制了高敏葡萄糖和半乳糖安培生物傳感器。PDA基質(zhì)具有優(yōu)異的吸附性能和生物相容性，有利于高效固定酶和納米增敏。與CEP法相比，

7、基于該P(yáng)BNCs的酶電極更靈敏，金和鍍鉑金電極上對(duì)葡萄糖的檢測靈敏度分別達(dá)99和129μA cm-2 mmol-1L。基于PBNCs的第二代安培傳感器亦有優(yōu)異性能。
　　 ⑷提出了化學(xué)氧化聚合-磁性分離/固定新方法用于高效固定酶，藉此研制了高敏葡萄糖安培生物傳感器。先采用化學(xué)共沉淀法合成了Fe3O4@Au核殼型磁性復(fù)合納米粒子，然后據(jù)化學(xué)氧化聚合法制得聚1，6-已二硫醇(PHDT)-GOx-Fe3O4@Au納米復(fù)合物，并借助磁場

8、將該復(fù)合物分離/固定在磁性電極表面。所制酶電極對(duì)葡萄糖的檢測靈敏度達(dá)110μA cm-2 mmol-1 L，檢測限為0.3μmol L-1。該法簡便、省時(shí)、高效。
　　 ⑸提出采用新型HDT電聚合膜固定AuNPs、實(shí)現(xiàn)納米增敏壓電免疫傳感的新方法。通過EQCM等技術(shù)研究了HDT電聚合過程和機(jī)理。結(jié)合理論分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，定量考察了AuNPs在HDT電聚合膜上的覆蓋度和納米增敏效應(yīng)。比較研究了羊抗人免疫球蛋白G(anti-hIgG)

9、的吸附，及后續(xù)的與人免疫球蛋白G(hIgG)的免疫反應(yīng)。與常規(guī)HDT自組裝單層修飾電極相比，基于HDT電聚合膜的修飾電極可更有效地固定抗體、性能更穩(wěn)定、制備時(shí)間更短。新型硫醇聚合膜材料有望作為硫醇自組裝單層的有益補(bǔ)充而在生物傳感研究中廣泛應(yīng)用。
　　 ⑹基于化學(xué)氧化聚合法制備了免疫PBNCs：PDA-PtNPs-anti-hIgG復(fù)合物，該復(fù)合物免疫親合性高并可高效催化H2O2電還原，籍此研制了高敏三明治型安培免疫傳感器。該傳感

10、器可檢測低至0.018 ngmL-1的hIgG，具有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、再生性和特異性，可用于臨床人血清樣品中目標(biāo)物檢測。
　　 ⑺基于化學(xué)氧化法制備了PDA-PtNPs-GOx納米復(fù)合物，然后借助葡萄糖存在下酶生H2O2生化還原HAuCl4，在納米復(fù)合物表面原位生成AuNPs用于高效吸附固定抗體及酶標(biāo)GOx，制得GOxads/anti-hIgG/AuNPs/PDA-PtNPs-GOx生物納米復(fù)合物，籍此研制了高敏三明治型電化

11、學(xué)免疫傳感器。該法優(yōu)勢在于能在該生物納米復(fù)合物表面和內(nèi)部均高效固定GOx酶標(biāo)，有效地提高了酶標(biāo)的負(fù)載量及活性。以醌/氫醌為媒介體，實(shí)現(xiàn)了超敏免疫信號(hào)的輸出，所制免疫傳感器可檢測低至2 pg mL-1的hIgG。
　　 ⑻將AuNPs/PDA-PtNPs-GOx納米復(fù)合物滴干修飾于金電極表面，共價(jià)固定巰基化適體以特異結(jié)合凝血酶，以GOx標(biāo)記物的催化電流為信號(hào)輸出，研制了“信號(hào)衰減”型電化學(xué)適體傳感器。凝血酶與適體結(jié)合后產(chǎn)生傳質(zhì)阻力

12、，可顯著抑制標(biāo)記酶的催化反應(yīng)速度，降低酶生H2O2氧化電流。所制適體傳感器可檢測低至0.1 nmolL-1的凝血酶。
　　 ⑼結(jié)合磁分離/富集技術(shù)，提出了以適體纏繞的單壁碳納米管(SWCNTs)為放大平臺(tái)的新型三明治型適體安培傳感器。以凝血酶適體Ⅰ修飾的磁性納米粒子、凝血酶、凝血酶適體Ⅱ纏繞的SWCNTs構(gòu)建三明治型復(fù)合物，借助磁場將其分離并富集至磁性金電極上，通過亞甲基藍(lán)分子對(duì)SWCNTs上纏繞的適體Ⅱ的位置取代作用，成功分離