經(jīng)RAFT聚合制備PEG聚合物、生物分子復合物及其性能的研究.pdf

1、可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合是活性自由基聚合(LRP)的一種，可以應(yīng)用于廣泛的活性端基單體，制備復雜結(jié)構(gòu)聚合物，技術(shù)上具有更明顯的優(yōu)勢，利用RAFT聚合可以制備預定分子量和分子量分布窄的聚合物。此外，RAFT聚合還可用于各種自由基聚合的模式:溶液，乳濁液和懸浮聚合。在RAFT聚合反應(yīng)中，通常加入雙硫酯衍生物SC(Z) S—R作為鏈轉(zhuǎn)移試劑，聚合中它與增長鏈自由基Pn·形成休眠的中間體(SC(Z) S—Pn)，限制了增長鏈自由基之間

2、的不可逆雙基終止副反應(yīng)，使聚合反應(yīng)得以有效控制。這種休眠的中間體可自身裂解，從對應(yīng)的硫原子上再釋放出新的活性自由基R·，結(jié)合單體形成增長鏈，加成或斷裂的速率要比鏈增長的速率快得多，雙硫酯衍生物在活性自由基與休眠自由基之間迅速轉(zhuǎn)移，使分子量分布降低，從而使聚合體現(xiàn)可控/“活性”特征。
　　 RAFT聚合是一個通用、容易實現(xiàn)的方法。各種共聚物都可以用RAFT聚合合成，包括無規(guī)，接枝，嵌段共聚物。功能聚合物不僅可以選擇含功能基團的單體

3、進行聚合得到，也可以通過RAFT試劑在聚合物鏈的末端的優(yōu)勢，通過化學反應(yīng)連接上功能基團得到。有很多方法可以把RAFT聚合合成的聚合物末端的硫羰基進行功能改性。這其中包括二硫酯端基的還原成巰基，然后同乙烯基功能分子加成，或同一個新的自由基引發(fā)劑加成，形成一個新的大分子引發(fā)劑。近幾年，應(yīng)用RAFT聚合方法設(shè)計和合成新型高分子材料，例如基因/藥物輸送材料，生物材料，生物分子-高聚物復合物，有機-無機雜化材料，納米粒子等等，取得了很大進展。

4、r>　　 蛋白做為基礎(chǔ)的藥物直接使用，有一個很顯著的缺陷，那就是在體內(nèi)，蛋白質(zhì)容易被腎臟排除或由蛋白水解系統(tǒng)所消化，減少他們的治療效果。把蛋白表面連接水溶性聚合物可以減弱蛋白質(zhì)藥物被免疫系統(tǒng)識別出來，從而增加蛋白質(zhì)的循環(huán)時間。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是中性、無毒且具有良好的生物相溶性的高分子聚合物，20世紀70年代，PEG被用共價鍵連接到蛋白質(zhì)表面上，這個蛋白質(zhì)復合物被臨床證明毒性很小，體內(nèi)血漿循環(huán)時

5、間有明顯延長，同時，通過共價鍵連接到藥用蛋白的PEG也提高了蛋白質(zhì)溶解度，穩(wěn)定性和減少蛋白水解速率，即提高治療效率和蛋白質(zhì)療法的安全性。自1990年始，PEG已獲美國食品和藥物管理局(FDA)批準應(yīng)用于藥物領(lǐng)域。盡管藥用蛋白的聚乙二醇化(PEGlated)，即提高生物利用度和減少體內(nèi)的免疫抗原有明顯的好處，但還存在著一些固有的限制。傳統(tǒng)的蛋白聚乙二醇化技術(shù)，需要使PEG在較溫和的反應(yīng)條件下與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，也就是需將PEG活化，活化過程也就

6、是對PEG鏈的末端進行改性，需要繁重的合成和純化過程，沒有實用價值。現(xiàn)已經(jīng)證明，通過共價鍵連接得到的蛋白質(zhì)上的聚合物顯著降低蛋白的生物活性，其中很重要的影響因素就是聚合物的分子量和分子量分布，RAFT聚合可以得到預定的分子量(MWS)和分子量分布(PDI)狹窄的聚合物，同蛋白復合可以有利于保持蛋白活性，提高治療效果。除此之外，使用RAFT聚合可以用更多的新單體來合成帶功能基團聚合物，也可以很容易地得到端基帶有反應(yīng)功能基團的聚合物，通過化

7、學反應(yīng)，同蛋白相連，制備聚合物蛋白復合物。
　　 PEG除了修飾藥用蛋白分子之外，利用PEG分子的親水性和生物惰性，還可以制備PEG型的水凝膠，用在藥物載體和控制釋放領(lǐng)域。有些共價鍵在生物體內(nèi)廣泛存在，例如硫-硫鍵，在谷胱甘肽(GSH，在哺乳動物生物體內(nèi)和原核細胞中，谷胱甘肽分布很廣)）存在下，可以斷裂，因此，由硫-硫鍵連接的聚合物可以很容易的在生物體內(nèi)被分解成小的片段從而被排出體外。以前不同交聯(lián)方法（如光聚合或熱引發(fā)），使用不

8、同交聯(lián)劑來制備PEG凝膠。然而，由于很難避免的殘余有毒交聯(lián)劑，使它們不能應(yīng)用在生物醫(yī)學或藥學領(lǐng)域。因此，尋找新一代水凝膠所使用的交聯(lián)劑就成為非常關(guān)鍵的因素，因為所需的交聯(lián)劑必須是生物相容的，無毒的，并且要保證交聯(lián)性能。
　　 生物素和卵白素像其他生物親和對一樣，有高親和力(biotin-avidin system，BAS)。生物素-親和素系統(tǒng)是以生物素和親和素具有的獨特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，二者結(jié)合即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)

9、，它們的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定。除了生物素-親和素系統(tǒng)以外，利用環(huán)糊精同膽固醇之間的相互作用，也可以制備PEG凝膠，作為藥物載體應(yīng)用在生物醫(yī)學領(lǐng)域。
　　 基于以上考慮，我們嘗試利用RAFT聚合反應(yīng)來制備聚（甲基丙烯酸（聚乙二醇）酯）聚合物，并利用其容易端基功能化的特點，同藥用蛋白相連，起到延長藥用蛋白在體內(nèi)的循環(huán)時間，降低酶解速率，提高療效的作用。其次，就是利用PEG端基的功能基團，同生物分子連接，制備凝膠，期望能作為藥物控制釋

10、放的載體使用。
　　 首先我們設(shè)計合成了三種不同結(jié)構(gòu)的RAFT試劑，即生物分子沒有反應(yīng)活性的RAFT試劑，單官能團RAFT試劑和雙官能團RAFT試劑，然后通過RAFT聚合制備了分子端基和中間帶有可同蛋白質(zhì)反應(yīng)的活性基團的不同結(jié)構(gòu)和不同分子量的聚（甲基丙烯酸（聚乙二醇）酯）(poly(PEGMA)s)，將其同蛋白質(zhì)經(jīng)過胺基偶聯(lián)到蛋白質(zhì)表面，得到了系列poly(PEGMA)蛋白質(zhì)復合物，分別用凝膠色譜(GPS)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(

11、SDS-PAGE)，核磁共振(NMR)，紫外-可見色譜(UV-visible)，三硝基苯磺酸(TNBS)等方法對所得復合物進行了表征。與傳統(tǒng)的聚乙二醇化試劑相比，制備的聚乙二醇化試劑具有梳狀結(jié)構(gòu)，提高了其在蛋白質(zhì)表面反應(yīng)的選擇性，因此，制備的聚（甲基丙烯酸（聚乙二醇）酯）蛋白質(zhì)復合物的生物活性遠遠大于傳統(tǒng)的聚乙二醇化蛋白的生物活性。用不同分子量的甲基丙烯酸（聚乙二醇）酯為單體制備了相同分子量但是側(cè)枝長短不同的聚合物，并用它們同蛋白質(zhì)連接

12、制得復合物，所得復合物的生物活性如預期的一樣，分子量較高的單體制備的聚合物，同蛋白質(zhì)結(jié)合后有更多的生物活性。不同結(jié)構(gòu)聚（甲基丙烯酸（聚乙二醇）酯）聚合物同蛋白質(zhì)結(jié)合的實驗表明，聚合物的立體結(jié)構(gòu)有利于保持蛋白質(zhì)的生物活性。
　　 除了研究聚（甲基丙烯酸（聚乙二醇）酯）聚合物蛋白質(zhì)復合物的生物活性外，還利用生物素同卵白素交聯(lián)和膽固醇同環(huán)糊精相互作用制備了不同結(jié)構(gòu)的可生物降解的PEG凝膠。一是成功合成了含有二硫鍵的聚乙二醇低聚物，通過

13、端羥基的生物素化，生成了兩端帶有生物素的聚乙二醇低聚物，加入卵白素，通過生物素-卵白素的相互作用交聯(lián)形成水凝膠。所形成的水凝膠在二硫蘇糖醇(DTT)作用下分解，使凝膠解體。二是制備了一個含有環(huán)糊精的三臂化合物和一個含有膽固醇的三臂化合物，利用環(huán)糊精同膽固醇之間的相互作用，制備了凝膠，再利用硫-硫鍵的可生物降解特點，加入二硫蘇糖醇使凝膠分解，希望能作為藥物載體應(yīng)用在生物醫(yī)學領(lǐng)域。
　　 上述研究證明，RAFT聚合方法可以方便的得到

14、端基或中間帶有活性基團的聚合物，用于聚合物蛋白復合物的制備，這種方法比傳統(tǒng)的藥用蛋白聚乙二醇化方法有明顯的優(yōu)勢，避免聚乙二醇分高聚物的改性活化和繁瑣的提純過程，得到的梳狀聚合物蛋白復合物的生物活性明顯提高，如果應(yīng)用于臨床，可以顯著提高蛋白藥物的療效。利用生物素同卵白素交聯(lián)和膽固醇同環(huán)糊精相互作用制備的PEG凝膠，不僅生成了可生物降解的水凝膠，避免了有毒有害交聯(lián)劑的應(yīng)用，還在PEG直鏈中引入硫硫鍵，由于硫硫鍵的多少可以人為控制，因此，此種