可再生附屬器官的基因活性皮膚再生材料構建及性能研究.pdf

1、皮膚附屬器官的再生是皮膚組織修復與再生功能化的重要標志之一。盡管目前商業(yè)化的人工皮膚替代物能夠實現表皮和真皮的結構性修復，但皮膚附屬器官仍然缺失。為了在表皮和真皮組織修復的同時實現毛囊再生，以基因工程方法，將目的基因導入質粒，制備肝細胞生長因子質粒DNA(HGF-pDNA)，實現對目的蛋白HGF的持續(xù)表達。以骨髓間充質干細胞(BMSCs)為種子細胞，制備負載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料(GASM)。
　　將脂質體(Li

2、pofectamineTM2000)與pDNA利用靜電作用形成納米粒子來保護pDNA，將納米粒子導入膠原-殼聚糖支架，得到基因活性支架(GAS)，激光共聚焦顯微鏡(CLSM)及掃描電子顯微鏡(SEM)顯示納米粒子能夠均勻分散在支架中，并良好粘附在孔壁表面。將BMSCs種植到支架中，Western Blotting結果顯示，相對于空白支架，GAS能夠極大促進目的蛋白HGF的表達。利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及Wester

3、n Blotting對基因活性支架中毛囊特征因子多功能蛋白聚糖(Versican)、堿性磷酸酶(ALP)、Ⅳ型膠原(COLⅣ)分析顯示，三種信號因子在基因和蛋白水平的表達都較空白支架高，表明BMSCs被GAS誘導向毛囊定向分化。
　　以負載BMSC的空白支架(BSM)和HGF-pDNA GAS為對照組，將實驗組GASM植入SD大鼠的背部全層皮膚損傷模型中。大體觀察結果發(fā)現，實驗組能夠在再生表皮與真皮組織的同時，實現毛發(fā)的再生。對1

4、0d、21 d和35 d的組織切片H&E染色分析發(fā)現，在10 d時可見松散的團狀類毛囊結構，而21 d和35 d時這種結構逐漸成熟。為鑒定再生類毛囊結構，對再生組織進行免疫組化(IHC)分析發(fā)現，再生類毛囊結構呈現Versican、ALP和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)陽性，表明再生類毛囊結構具有毛囊特征。對其進行RT-qPCR及Western Blotting分析顯示，相對于對照組，實驗組10 d時在Versican、ALP和α-S

5、MA因子蛋白及基因水平的表達都較高。將雄性大鼠的BMSCs作為種子細胞植入雌性體內，采用Y染色體原位雜交的方法鑒定再生毛囊結構細胞來源，發(fā)現在10 d時部分細胞呈現Y染色體陽性，而在21 d時陽性細胞比例急劇下降，表明植入的外源性BMSCs與自體細胞共同參與再生組織毛囊結構的重建。
　　為了實現原位誘導再生，在不加入BMSCs的GAS中引入SDF-1，以期其能夠誘導自體干細胞參與毛囊再生。將合成的磺化殼聚糖(OCS)與聚賴氨酸(P