棉花、甜菜直接器官發(fā)生植株再生及轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、作為世界性重要經(jīng)濟(jì)作物的棉花，由于其生長發(fā)育期恰好與各種自然災(zāi)害的頻發(fā)季節(jié)相重疊，因此對棉花品種性狀的要求顯得比其他任何作物都復(fù)雜，傳統(tǒng)的棉花育種方法發(fā)展到今天面臨著種質(zhì)資源貧乏、遠(yuǎn)緣雜交困難等問題，這就使有益性狀的結(jié)合，尤其是高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗性狀的有機(jī)結(jié)合十分困難。利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種的研究越來越受到科學(xué)研究者的關(guān)注。然而目前棉花生物技術(shù)的發(fā)展仍然存在著很多障礙，如棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因型依賴性、棉花組織培養(yǎng)的低效性(耗時、

2、耗工)、基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性(難重復(fù)，轉(zhuǎn)化率低)和轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀的變異等等，這些問題已經(jīng)成為棉花生物技術(shù)、棉花功能基因的驗證和棉花相關(guān)基因克隆等研究領(lǐng)域的障礙和瓶頸。
　　 甜菜是重要的糖用和飼料作物，糖用甜菜提供了全球約30％的食糖；飼料甜菜是家畜最佳的多汁飼料，塊根肥大，營養(yǎng)豐富。由于栽培馴化時間較短，加上它又是一種2年生的異交作物，遺傳背景狹窄，資源貧乏。特別是自交高度不親和性，往往使得優(yōu)良單株基因型很容易丟失，給優(yōu)

3、良品種選育材料的繁殖和保存帶來了極大困難。現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展給甜菜育種方法開辟了一條新途徑。然而，由于甜菜組織培養(yǎng)重復(fù)性差，愈傷組織難以誘導(dǎo)，植株再生受基因型限制，這些問題嚴(yán)重影響到植物基因工程技術(shù)在甜菜育種上的實際應(yīng)用，加劇了傳統(tǒng)育種方法的局限性，導(dǎo)致我國糖甜菜與甘蔗糖競爭中處于極大劣勢，種植面積大幅度減少，產(chǎn)業(yè)的發(fā)展面臨嚴(yán)峻考驗。
　　 為此，本項研究擬通過對棉花、甜菜作物的莖尖、子葉節(jié)、上胚軸、莖節(jié)等外植體誘導(dǎo)直接器官發(fā)生

4、植株再生及轉(zhuǎn)基因的研究，解決棉花、甜菜離體培養(yǎng)植株再生嚴(yán)重依賴基因型且周期長、畸形率高、基因轉(zhuǎn)化率低等問題，為構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的技術(shù)平臺奠定基礎(chǔ)，為優(yōu)良材料的繁殖、保存提供技術(shù)支撐，為植物器官發(fā)育研究建立較好的實驗?zāi)Ｐ汀Ｑ芯績?nèi)容包括六大部分：棉花莖尖離體培養(yǎng)植株再生及遺傳轉(zhuǎn)化的研究；棉花子葉節(jié)離體培養(yǎng)植株再生的研究；棉花上胚軸離體培養(yǎng)植株再生的研究；甜菜品種(系)基因轉(zhuǎn)化和再生體系的建立；甜菜離體培養(yǎng)直接器官發(fā)生植株再生的研究；甜

5、菜莖節(jié)多芽形態(tài)發(fā)生的研究。取得的主要研究成果如下：
　　 1、棉花莖尖分生組織是最適合用于植株再生和繁殖的，其再生系統(tǒng)是理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，但再生效率較低，每個莖尖只能再生一個植株。
　　 2、建立了陸地棉、海島棉子葉節(jié)離體培養(yǎng)直接植株再生的技術(shù)，這是國內(nèi)首次將子葉節(jié)外植體用于棉花離體培養(yǎng)植株再生的研究。研究結(jié)果表明：海島棉與陸地棉子葉節(jié)誘導(dǎo)多芽發(fā)生再生植株種間差異明顯，海島棉子葉節(jié)誘導(dǎo)多芽植株再生比較容易，陸地棉子

6、葉節(jié)誘導(dǎo)多芽植株再生相對困難，但種內(nèi)不同品種間的差異不明顯，即品種間不存在基因型限制。另外，摸索出一種棉花再生芽高效生根培養(yǎng)基配方，海島棉與陸地棉兩棉種的再生芽在生根上也存在較大差異，陸地棉品種再生芽生根率為72％，海島棉生根率最高可達(dá)到90％以上。
　　 3、從對棉花莖尖和子葉節(jié)直接再生植株研究獲得啟示，以及根據(jù)植物發(fā)育的分子遺傳學(xué)特點，通過采用有效抑制頂端優(yōu)勢的處理，建立了棉花上胚軸及斬首上胚軸外植體離體培養(yǎng)直接多芽發(fā)生植株

7、再生的技術(shù)，達(dá)到不依賴基因型、簡單、快速的效果。該項技術(shù)已經(jīng)申請了國家專利。
　　 4、建立了甜菜子葉節(jié)等外植體離體培養(yǎng)植株再生及轉(zhuǎn)基因的技術(shù)，尋找到一種高效生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA3mg/L+1％蔗糖，生根率可達(dá)90％以上，根系粗狀、發(fā)達(dá)，移栽易成活。并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對甜菜子葉節(jié)進(jìn)行了轉(zhuǎn)外源基因的研究，獲得了PCR檢測陽性植株。該項成果作為主要創(chuàng)新點獲得新疆維吾爾自治區(qū)2005年度科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎。
　　 5、

8、根據(jù)甜菜特有的叢生生長習(xí)性，提出了莖節(jié)外植體的概念，并用其建立了離體培養(yǎng)補(bǔ)依賴基因型直接多芽發(fā)生植株再生的技術(shù)，再生芽誘導(dǎo)率明顯高于子葉節(jié)外植體。并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對甜菜莖節(jié)進(jìn)行了轉(zhuǎn)外源基因的研究，獲得了PCR檢測陽性、Southernblot鑒定外源基因整合到甜菜染色體上的植株。
　　 6、觀察了甜菜莖節(jié)多芽的起源和形態(tài)發(fā)生，結(jié)果表明：莖節(jié)外植體從培養(yǎng)的第三天，在葉腋的表皮或表皮下1～2層細(xì)胞開始分裂，到第五天已形成了小凸起，

9、第七天可以看到2個芽(平面切片圖)，即器官原基是在外源激素作用下重新形成的，并能分裂產(chǎn)生多個。
　　 綜上所述，本研究所用棉花的外植體從莖尖到子葉節(jié)再到上胚軸及斬首上胚軸，這些外植體在組織結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，僅是發(fā)育階段不同，但在對不同生長時期的頂端分生組織區(qū)采取有效抑制頂端優(yōu)勢的處理后，可以實現(xiàn)打破基因型限制瓶頸的目標(biāo)，增強(qiáng)多芽產(chǎn)生的可重復(fù)性、可操作性，從而使棉花組織培養(yǎng)植株再生的技術(shù)更加完善，對利用基因工程遺傳改良棉花品種綜合性

10、狀和生產(chǎn)的深入意義重大。
　　 本研究根據(jù)甜菜營養(yǎng)生長叢生的特點和植物發(fā)育的理論，利用莖節(jié)作外植體建立了不依賴基因型、重復(fù)性好、操作簡單、變異率小的高效植株再生技術(shù)平臺，克服了甜菜植株再生的諸多困難，為遺傳工程技術(shù)在甜菜育種上的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。與此同時，通過對甜菜離體培養(yǎng)芽形態(tài)發(fā)生的觀察，揭示甜菜莖節(jié)芽器官原基是在外源激素的作用下重新形成的，并分裂增殖形成多芽，為甜菜離體培養(yǎng)多芽發(fā)生提供了科學(xué)依據(jù)，為提高甜菜遺傳轉(zhuǎn)化的效率、