膠原基雙層支架用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)及附屬器官再生的研究.pdf

1、膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，膠原分子中包含有促細(xì)胞黏附和生長的RGD多肽片段，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，在組織工程皮膚領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。本文旨在以膠原為基本材料，以牛跟腱為原料利用乙酸和胃蛋白酶結(jié)合抽提的方法，改進(jìn)膠原的提純工藝。實驗結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)溫度為4℃，乙酸溶脹時間為24h，胃蛋白酶濃度為0.1％，鹽析濃度為2.6M，鹽析時間為12h，最終膠原的純度在98％以上。通過紅外光譜，紫外光譜及氨基酸自動分析儀將所提取的蛋白質(zhì)定性為膠

2、原;通過SDS-PAGE凝膠電泳測試出所提取的膠原蛋白分子量大于300k Da，且純度高。通過透射電子顯微鏡觀察到了膠原在溶液中的纖維狀形態(tài)。熱學(xué)性能檢測出了膠原的熱變性溫度在65℃左右。膠原的重金屬元素以及總糖含量都符合國家標(biāo)準(zhǔn)。
　　在此基礎(chǔ)上，以自提膠原和殼聚糖為主要原料，采用風(fēng)干-冷凍凍干的方法，進(jìn)一步仿生模擬人體皮膚的結(jié)構(gòu)與功能，構(gòu)建了一種具有雙層結(jié)構(gòu)的皮膚再生支架:不對稱膠原抗菌雙層支架。致密層將包裹抗菌藥物磺胺嘧啶銀

3、的明膠微球負(fù)載在膠原纖維上模擬皮膚的表皮層，起著避免細(xì)菌侵入、防止水分蒸發(fā)等作用。而多孔層由膠原-殼聚糖三維支架構(gòu)成，具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，模擬真皮的細(xì)胞外基質(zhì)，以誘導(dǎo)缺損真皮組織再生。膠原不對稱抗菌支架具有良好的力學(xué)性能，可以控制水蒸氣的蒸發(fā)，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有明顯的抑制作用。磺胺嘧啶銀可持續(xù)緩釋72h，有效避免了直接加藥的細(xì)胞毒性。體外的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)證明，膠原不對稱抗菌支架具有良好的細(xì)胞相容性及細(xì)胞活性。
　　為了在

4、表皮和真皮組織修復(fù)的同時實現(xiàn)汗腺再生，構(gòu)建了可表達(dá)表皮生長因子(EGF)和外環(huán)蛋白(EDA)的功能質(zhì)粒pDNA-EGF和pDNA-EDA，實現(xiàn)對目的蛋白EGF和EDA的持續(xù)表達(dá)。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為種子細(xì)胞，制備負(fù)載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料。以負(fù)載BMSC的空白支架和pDNA-EGF的硅膠膜/膠原殼聚糖雙層支架(BDE)為對照組，將負(fù)載pDNA-EGF，pDNA-EDA及pDNA-EGF/EDA/MSC的實

5、驗組BDEs植入SD大鼠的腳掌全層皮膚損傷模型中。對2W、4W和8W的組織切片HE染色分析發(fā)現(xiàn)，在8W時實驗組中發(fā)現(xiàn)了類似線圈形狀的單管狀汗腺結(jié)構(gòu)。為鑒定再生類汗腺結(jié)構(gòu)，對再生組織進(jìn)行免疫組化(IHC)分析發(fā)現(xiàn)，再生類汗腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)CEA、CK8和CK14陽性，表明再生類汗腺結(jié)構(gòu)具有汗腺特征。對其進(jìn)行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)及蛋白免疫印跡(Western Blotting)測試，相對于對照組，實驗組的CEA、 CK8和CK