青海湖裸鯉HIF-1αODD域羥化分析及青藏高原3種小哺乳動物HIF-2α基因的克隆.pdf

1、青藏高原(Tibetan Plateau)，世界海拔最高的高原，平均海拔4000-5000米，位于中國西南地區(qū)，氣候干燥，空氣稀薄，太陽輻射較強，氣溫較低。且高原自然生態(tài)系統(tǒng)脆弱，易受外界因素干擾破壞。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-induciblefactor，HIF)，是由α亞基和β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其活性主要由α亞基決定，能夠?qū)Χ喾N下游基因進行調(diào)控，從而使細胞適應(yīng)低氧，維持低氧細胞生理穩(wěn)態(tài)。目前已知的HIF家族包括:HI

2、F-1，HIF-2和HIF-3，其α亞基分別為HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α，它們都對細胞內(nèi)氧分壓敏感，受氧濃度的調(diào)節(jié)。研究表明，青海湖裸鯉HIF-1α的ODD功能域中的羥化酶識別位點的保守序列為:PEMLAP(550-555)，與其它脊椎動物保守序列(LXXLAP，X代表任意氨基酸)不符，可能致使青海湖裸鯉具有與普通魚類不同的適應(yīng)低氧機制。目前HIF的研究主要集中在HIF-1α，對HIF-2α的分子結(jié)構(gòu)、表達特征及低氧狀態(tài)下

3、的調(diào)控機制了解有限，因此，通過研究青海湖裸鯉HIF-1α羥基化作用的差異及青藏高原4種脊椎動物HIF-2α分子進化，對進一步闡明裸鯉和高原小哺乳動物的低氧適應(yīng)機制，具有重要的理論和實踐意義。
　　首先提取青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）肝臟組織總RNA，通過RT-PCR獲得裸鯉HIF-1α的cDNA全長，克隆HIF-1α基因1546-1752序列（包含PEMLAP，氨基酸序列516-584），對克隆片段

4、1649進行點突變(序列為LEMLAP)，克隆到表達載體pGEX-4T-2中（突變后命名為OE，野生型為HI），IPTG誘導(dǎo)表達，并用GST Resin純化得到重組蛋白GST-HI及GST-OE蛋白，冷凍干燥備用。
　　提取斑馬魚總RNA，通過RT-PCR獲得PHD2的cDNA全長，克隆PHD2編碼區(qū)序列到pET-32表達載體，IPTG誘導(dǎo)表達，用Ni柱純化得到trx-PHD2重組蛋白，4℃過夜透析，經(jīng)Bradford法測定透析后

5、重組蛋白pET-32-PHD2濃度為1mg/mL，將GST-HI/GST-OE進行HPH反應(yīng)，western blot檢測。發(fā)現(xiàn)GST-HI/GST-OE均能與PHD2通過底物/酶相互作用結(jié)合，但GST-OE與GST-HI相比對PHD2具有更高的親和力，同時，GST-OE條帶羥化后電泳遷移率發(fā)生改變，羥化的GST-OE電泳遷移率略快于未羥化的GST-OE條帶，而GST-HI條帶未發(fā)現(xiàn)遷移率的差異，表明重組蛋白trx-PHD2具有一定的羥

6、化活性，重組蛋白GST-OE被PHD2識別結(jié)合并羥化的能力要明顯高于重組蛋白GST-HI，說明與其它魚類相比，青海湖裸鯉的HIF-1α的ODD功能域不易被羥化酶識別和羥化，可能是青海湖裸鯉長期進化適應(yīng)高原鹽湖環(huán)境的結(jié)果。
　　通過提取青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）、高原鼢鼠（Myospalaxbaileyi根田鼠（Microtus oeconomus）及高原鼠兔（Ochotona curzoniae）