青海湖裸鯉鈣調(diào)蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)的克隆、表達(dá)、和功能研究.pdf

1、青海湖裸鯉是分布于青海湖及其周邊流域的唯一的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類,在魚(yú)-鳥(niǎo)-草地生態(tài)系統(tǒng)中處于核心地位。開(kāi)展青海湖裸鯉基礎(chǔ)生物學(xué)特征和適應(yīng)低氧、低溫、高鹽度的分子機(jī)理的研究,有助于揭示青海湖裸鯉的基本生命活動(dòng)規(guī)律,為該魚(yú)種的資源保護(hù)和人工增殖放流提供理論依據(jù)。
　　為了在基因功能研究中得到可靠地內(nèi)參基因,通過(guò)RT-PCR和RACE方法得到了青海湖裸鯉三磷酸甘油醛脫氫酶(Gp-GAPDH)基因兩種異形體的完整編碼序列,分別命名為Gp-GAPDH

2、α(JX287372)和Gp-GAPDHβ(JX287373),同時(shí)對(duì)于Gp-GAPDHα和Gp-GAPDHβ在不同的組織和受精卵發(fā)育不同階段的表達(dá)量進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Gp-GAPDHα與Gp-GAPDHβ在青海湖裸鯉不同組織和受精卵發(fā)育不同階段表達(dá)量存在較大差異,尤其Gp-GAPDHβ在受精卵發(fā)育不同階段差異顯著。初步斷定Gp-GAPDHβ不適合作為參照基因,而Gp-GAPDHα表達(dá)穩(wěn)定性需要進(jìn)一步研究,選擇其作為參照基因需謹(jǐn)慎。

3、　　鈣調(diào)蛋白磷酸酶(CN),是由催化亞基(CN A)和調(diào)節(jié)亞基(CN B)組成的異二聚體的蛋白酶,它在多項(xiàng)生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,是一個(gè)多功能的信號(hào)酶,它可被Ca2+和鈣調(diào)蛋白所激活。從青海湖裸鯉鰓組織通過(guò)RT-PCR和RACE方法克隆得到了CNA的兩個(gè)旁系同源體(GpCAα and GpCAγ)基因序列以及CNB序列,通過(guò)real time方法研究了其在胚胎發(fā)育不同階段和鹽度適應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式,同時(shí)通過(guò)免疫組化方法確定了其在腎臟、心

4、臟、腦子、精巢和鰓等不同組織中的分布特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn),青海湖裸鯉卵細(xì)胞受精后,GpCAα、GpCAγ和GpCB三種基因都在胚胎發(fā)育中持續(xù)性表達(dá),同時(shí)表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì),GpCAα和GpCB在神經(jīng)胚期表達(dá)量達(dá)到最小,相比之下,GpCAγ則在原腸胚期表達(dá)量最少。在鹽度的適應(yīng)過(guò)程中,GpCAα和GpCAγ表達(dá)量隨著鹽度的逐漸升高而升高,而GpCB表達(dá)量在脅迫初期升高之后卻有下降的趨勢(shì)。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法確定了CN在青海湖裸鯉腎、心臟、腦子、